链霉菌属磷脂酶D的底物识别机制和缩醛磷脂的酶法测定剖析.docVIP

链霉菌属磷脂酶D的底物识别机制和缩醛磷脂的酶法测定 Yusaku Matsumoto and Daisuke Sugimori* Department of Symbiotic Systems Science and Technology, Graduate School of Symbiotic Systems Science and Technology, Fukushima University, 1 Kanayagawa, Fukushima 960-1296, Japan Received 8 January 2015; accepted 28 February 2015 Available online xxx 摘要 本文研究了链霉菌属磷脂酶D的底物识别机制和胆碱缩醛磷脂的酶法测定。来自链霉菌属NA684菌株的磷脂酶D（PLD684）从培养的上层清夜中进行纯化，最终得到的酶比活力提高了184倍，总活力的回收率为23.7%。在pH为5.0，温度为80℃时获得对L-α-溶血卵磷脂（LPC）的最大水解活力。反应混合物中Triton X-100的浓度对水解活力的影响十分显著。当含有0.05-0.5%和0.1-0.2%（湿重/体积）的Triton X-100时，2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱Triton X-100；当Triton X-100含量超过0.05%时，水解活力反而被抑制。相比于脂质体单体底物，酶更优先与混合胶束类底物结合，1小时内对混合胶束底物的水解率达到98.4%。动力学分析表明，混合胶束POPC和乳化的LPC水解反应的速率限制步骤分别为bulk step和the surface step。这一结论表明，PLD684在识别由于磷脂质不同的头部和尾部造成具有不同物理性质的底物时，有至少两种底物识别机制。了解PLD684如何识别底物类型，对阐明自然中解脂蛋白的作用是非常有用的。此外，我们还报道了利用PLD684和磷脂酶B进行酶法测定胆碱缩醛磷脂含量。这是第一次利用酶法测定胆碱缩醛磷脂含量。 关键词 链霉菌属；磷脂酶D；动力学；函数式；底物识别；缩醛磷脂的测定 前言 磷脂酶D催化甘油磷脂中磷酸二之键的断裂水解，形成磷脂酸和相应的醇。一些PLD具有转酯活力。例如，在乙醇胺存在的环境下，卵磷脂（PC）转化为磷脂酰乙醇胺（PE）。一些来自链霉菌属（包括链霉菌antibioticus，链霉菌cinnamoneum，链霉菌halstedii，链霉菌septatus和链霉菌PMF菌株）HxKxxxxD序列。Leiros等人做出来了来自链霉菌属PMF的PLD的晶体结构。PLDPMF是一种单体蛋白质：由两个具有相似拓扑结构的域组成。晶体结构和突变研究揭示了底物结合方式。然而，PLD对胶束形式的底物识别机制还不确定，只知道相比于单体底物，PLD通常更倾向于与聚合形底物进行结合。之前的研究已经说明了PLD的活性取决于底物形式，例如脂质体单体，乳化的脂质体或混合胶束底物。PLD在胶束型底物的界面处表现出最高的活性，与胶束形式和单体底物相比，PLD对磷脂囊的活性显著降低。因此，底物的形式是决定酶活的关键。但是PLD是如何识别底物形式的尚不清楚。为了清楚底物识别机制，对解脂蛋白提出了一个新看法。 在当前的研究中，我们报道了来自链霉菌属NA684菌株的磷脂酶PLD684对脂质体单体，乳化的脂质体或混合胶束底物的水解活力。此外，我们演示了在有Triton X-100时，对混合的PC胶束和乳化的LPC这种不同底物的识别机制和酶法测定胆碱缩醛磷脂。 药品及研究方法 药品 L-α-溶血卵磷脂，鸡蛋（LPC），1-十六酰基-2-油酰-锡-丙三醇-3-磷脂酰胆碱（POPC），1-O-1′-(Z)-油胺-2-羟基-锡-丙三醇-3-磷脂酰胆碱（胆碱溶血缩醛磷脂，LPLS-PC），1-（1Z-油胺）-2-四烯酸-锡-丙三醇-3-磷脂酰胆碱（胆碱缩醛磷脂，PLS-PC），1-十六酰基-2-油酰-锡-丙三醇-3-磷脂酰乙醇胺（POPE），1-O-1′-(Z)-油胺-2-羟基-锡-丙三醇-3-磷脂酰乙醇胺（乙醇胺溶血缩醛磷脂，LPLS-PE），1-（1Z-油胺）-2-四烯酸-锡-丙三醇-3-磷脂酰乙醇胺（乙醇胺缩醛磷脂，PLS-PE），1-十六酰基-2-油酰-锡-丙三醇-3-磷脂酰甘油（POPG），L-α-溶血磷脂酰乙醇胺（LPE），L-α-磷脂酰肌醇（PI），产自鸡蛋黄的鞘磷脂（SM），锡-甘油-3-磷脂酰胆碱（GPC），细菌蛋白胨，Toyopearl Phenyl-650M，HiTrap Q HP，RESOURCE PHE 和Mono S色谱柱，胆碱氧化酶（COD），过氧化物酶（POD）4-氨基安替比林，N，N-二（4-磺丁基）-3-甲基苯胺的二钠盐（