酵母转化及杂交20131218.docVIP

酵母感受态的制备 将原始菌株AH109在YPDA平板上划线培养挑取单菌落，在 mL YPDA培养基中，30，20 r/min，培养至OD 600为12（16-18hr）； 接种5 mL活化的菌至 mL YPDA（OD 600为0.150.3）液体培养基中扩大培养，30，20 r/min，OD 600为0.0.6（3hr），室温×g/min，离心收集菌体 将菌体重悬于0 mL灭菌ddH2O1×TE中室温×g/min，离心将菌体重悬于3 mL 1.1×TE/LiAc1.1 ml of 10× TE with 1.1 ml of 1 M LiAc (10×) Bring the total volume to 10 ml using sterile,deionized H2O）溶液分装到2个1.5 mL离心管中，室温，1000 r/min，离心15 s 弃上清，将菌体重悬于 μL 1.1×TE/LiAc溶液中。在 mL灭菌离心管中加入： 试剂 加样量（μL） DNA（25 ng/μl） 5 pGADT7-Rec（500 ng/μL） 0.5 Herring tests carrier DNA（10 μg/μL） 10 AH109/Y187感受态 100 使用前，取50 μL carrier DNA于新的离心管中，100加热5 min，立即冰浴5 min，重复1次轻轻震荡混匀 加入μL PEG/LiAc，混匀后置于30培养 min，每1 min混匀1次 加入 μL DMSO，混匀，42水浴 min，每 min混匀1次室温，700 r/min，离心 min，菌体重悬于 mL YPDA培养基中30 ℃，120 r/min，培养90 min。 室温，700 r/min，离心 min，菌体重悬于 mL 1×TE（0.9%NaCl）溶液中将菌液涂布在SD/-SD/-Leu平板上，每个100 mm的平板涂菌液00 μL（按照1/101/100、1/1000的比例稀释菌液，检测转化效率）将平板倒置于30培养箱中，培养3，长出单菌落。在 mL灭菌离心管中加入： 试剂 加样量（μL） DNA（25 ng/μl） 0 载体pGADT7-Rec（500 ng/μL） 20 Herring tests carrier DNA（10 μg/μL） 10 AH109/Y187感受态 200 使用前，取50 μL carrier DNA于新的离心管中，100加热5 min，立即冰浴5 min，重复1次轻轻震荡混匀 加入μL PEG/LiAc，混匀后置于30培养 min，每1 min混匀1次 加入 μL DMSO，混匀，42水浴 min，每 min混匀1次 室温，700 r/min，离心 min，菌体重悬于 mL 1×TE溶液中将菌液涂布在SD/-SD/-Leu平板上，每个100 mm的平板涂菌液00 μL（按照1/101/100、1/1000的比例稀释菌液，检测转化效率） 将平板倒置于30培养箱中，培养3，长出单菌落。 挑取诱饵质粒pGBKT7-C8YTH、pGBKT7-C8YTH1 转化 Y187 的单克隆(2-3mm)分别接种于 50mL SD/-Trp/Kan (20 μg/ml) 液体培养基。30°C 250-270rpm 培养过夜（16-24h）。 检测过夜培养物的 OD600，如果 OD600≥0.8，1000×g/rpm 离心 5min，弃上清。 沉淀重悬于 5mL SD/-Trp 液体培养基中，用细胞计数器计数细胞密度。细胞密度应该大于 1×109/mL。 取分装冻存的水稻酵母双杂交文库AH109菌株1管，室温28℃水浴融化菌体； 在2 L灭菌三角瓶中，将5 mL pGBKT7-C8YTH / pGBKT7-C8YTH1转Y187的酵母菌液与融化的AH109文库菌液1mL混合，加入45 mL 2×YPDA/Kan（50 μg/mL）液体培养基，轻轻混匀； 30 ℃，50 r/min，培养20-24 h； 取1滴菌液，显微镜下观察酵母交配的进程（酵母若交配成功，则呈现三个细胞相连的状态，其中两个是单倍体的母本细胞，第三个是出芽的二倍体细胞），如果交配成功，继续培养4 h； 室温，1000 × g，离心10 min，收集菌体；用 0.5×YPDA/Kan (50μg/mL) 冲洗杂交用的三角瓶两次，每次用 30mL，在同一个离心管中，1000 × g 离心 10min，弃上清。 1000 × g 离心 10min 后，用 10ml 的 0.5×YPDA/Kan (50μg/ml) 重悬。并计算悬浮的菌液的总体积。 100μL 杂交混合物备用（将剩余的杂交混合物），将200μL菌体均匀涂布在含有合适浓度3-AT的SD/-His/-