NY_T2679-2015甘蔗病原菌检测规程宿根矮化病菌环介导等温扩增检测法.docVIP

ICS 65.020B 16 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2679—2015 甘蔗病原菌检测规程宿根矮化病菌环介导等温扩增检测法 Detection procedures of sugarcane pathogen—Leifsonia xyli subsp.xyli—Detection method of loop-mediated isothermal amplification 2015-02-09 发布 2015-05-01 实施 中华人民共和国农业部发布 刖 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国果品标准化技术委员会(SAC/TC 510)归口。 本标准起草单位:福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室、农业部甘蔗及制品 质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人:许莉萍、阙友雄、郭晋隆、吴期滨、陈如凯、周定港、罗俊、陶玲。 甘蔗病原菌检测规程宿根矮化病菌环介导等温扩增检测法 1范围 本标准规定了环介导等温扩增技术检测甘鹿宿根矮化病菌(Xez/soma subsp. 的原理、试 剂和材料、仪器和设备、操作步骤、结果判定与表述等技术内容。 本标准适用于甘蔗组培苗、田间植株、种苗、种茎中甘蔗宿根_化病菌的LAMP检测。 2缩略语和符号 1下列缩略语适用于本标准 1. 1 LAMP:loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增。 1. 2 dNTPs Mixture:deoxyribonucleoside triphosphates mixture，脱氧核苷三_酸混合液。 1. 3 ddH2():d〇ubie distilled H2O,双蒸水。 1.4 CTAB:，hexadccyhrimethylaminoniuin bromide，十六烧基三甲基溴化铵。 1. 5 Tris: tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，三(轻甲基)氣基甲燦。 1.6 EDTA:Edetatc disodium，乙二胺四乙酸钠。 1. 7 LF: forward loop primer，正向环引物。 1. 8 LB:backward loop primer，反向环引物。 2.2下列符号适用于本标准 2_2. 1 F3c:在靶基因的^末端设定的一个区段。 | 2. 2 F2c:在靶基因的3末端设定的一个区段，位于F3c的5%。 2. 3 Flc:在粑基因的^末端设定的一个区段，位于F2c的5端。 2.2.4 B1:在靶基丙的5末端设定的一个区段。 2. 5 B2:在靶基因的5末端设定的一个区段，位于B1的5端。 2. 6 B3:在靶基因的5末端设定的一个区段，位于B2的5端。 2. 7 F3(forward.outer primer):正向外引物，含有与目标DNA上的F3c序列互补的区段。 2. 8 B3(backward outer primer):反向外引物，含有与目标DNA上的B3相词序列的区段。 2. 9 FIP(forward inner primer):正向内引物，在3末端含有与？2。2补的F2区段，在Y末端含有 与Flc相同序列的区段。 2. 10 BIP(backward inner primer):反向冉弓!.物_，_在..3:末端|有与B2c互补的B2区段，在5末端含 有与Blc相同序列的区段。 3原理 LAMP是一种恒温核酸扩增方法。DNA在65°C左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离成为单链。在耙基因的3末端设定F3c、 F2c、Flc3个区段，在W末端设定B1、B2、B3 3个区段。针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用 链置换DNA聚合酶在等温(65°C左右)条件下保温一定的时间，即可完成核酸扩增反应。以感染了甘 廉宿根矮化病菌Xe￡/som_a subsp.巧仏Lxx)的甘鹿为供试样品，提取的甘鹿总DNA里含有病原 细菌的DNA,可用于检测。 4试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯。 1 2XCTAB 抽提缓冲液：含 100 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0)，20 mmol/L EDTA，1. 4 mol/L NaCl， 0% CTAB，配方见附录A。该缓冲液在121°C下热灭活20 min~30 min，使用前加人0? 1%(V/V)的 P-巯基乙醇。 2氯仿/异戊醇(V/V)=24 : 1。 4.3检测引物序列。 3. 1 F3:5ACATCGGTACGACTGGGT - 3，。 3. 2 B3:5TGGCCGACCAAAAAAGGT - 3，。 3.