NY_T2678-2015马铃薯6种病毒的检测RT-PCR法.doc

ics 65.020.01B 15 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2678-2015 马铃薯6种病毒的检测RT-PCR法 Detection of the six potato viruses—RT-PCR method 2015-02-09 发布 2015-05-01 实施 中华人民共和国农业部发布 刖 g 本标准按照GB/T 1. 1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位:农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）、湖南农业大学园艺学 院、华中农业大学生命科学技术学院、福建农林大学。 本标准主要起草人:张威、白艳菊、李学湛、柳俊、詹家绥、聂碧华、胡新喜、何长征、高艳玲、范国权、 申宇、张抒、王晓丹、王文重、魏琪、邱彩玲、耿宏伟、董学志、万书明。 马铃薯6种病毒的检测RT - PCR法 1范围 本标准规定了马铃薯S病毒(Pota如wrtw S，PVS)、马铃薯X病毒(Po如〇 hrjw X，PVX)、马铃薯 M病毒（Po加o wzVjw M，PVM)、马铃薯Y病毒（Po加〇 y，PVY)、马铃馨卷叶病毒（Potato Zea/- ro wfrws，PLRV)和马铃薯A病毒（fWaio wirMS A,PVA)的反转录聚合酶链式反应（RT- PCR)分子 生物学检测方法(见附录A)。 本标准适用于马铃薯试管苗、原原种和田间马铃薯块茎、植株等组织中病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 本标准采用反转录一聚合酶链式反应（reverse~transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 方法检测马铃薯病毒。其原理是，将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的 技术，RNA在反转录酶的作用下反转录成cDNA，再以cDNA为模板，在Taq DNA聚合酶的作用下进 行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段，从而达到鉴定病毒的目的。 4试剂和材料 以下所有试剂，除非另有规定仅使用分析纯试剂，水为符合GB/T 6682中规定的一级水。 1 TRIzol RNA提取试剂 4.2三氯甲烷 4.3异丙醇 4 75%乙醇 量取无水乙醇75 mL，加水定容至100 mL。 5 M-MLV 反转录酶(200U/L) RNA 酶抑制剂(40U/L) 7 Taq DNA 聚合酶(5 U/L) 8 10 X PCR buffer (Mg2 + free) 4.9 MgCI2(25mmoI/L) 10 dNTP 混合物(各 2. 5 _〇丨/L) 4.11焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水 在100mL水中，加入焦碳酸二乙酯（DEPC)50 pL，室温过夜，121°C高温灭菌20 min,分装到 1. 5 mL DEPC处理过的离心管中。 4. 12 10XTAE电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷(Tris)242 g，冰乙酸57. 1 mL，乙二胺四乙酸二钠? 2H20 37. 2 g，用氢氧化钠调 pH至8. 5,加水定容至1 000 mL。 13 1XTAE电泳缓冲液 量取10XTAE电泳缓冲液(4. 12)100 mL，加水定容至1 OOO mL。 14溴化乙锭溶液（10mg/L} 称取溴化乙锭200 mg，加水溶解，定容至20 mL。 15 1.5 %琼脂糖凝胶板 称取琼脂糖1. 5 g，加入1XTAE电泳缓冲液(4. 13)定容至100 mL，微波炉中加热至琼脂糖融化， 待溶液冷却至50°C?60°C时，加溴化乙锭溶液(4. 14)5 (xL，摇勻，倒人制胶板中均勻铺板，凝固后取下 梳子，备用。 16引物缓冲液 用DEPC水将上、下游引物分别配制成浓度为100 ng/jxL的水溶液。 17 100 bp DNA分子量标准物 18阳性对照 参见附录B中B. 1。 19阴性对照 参见附录B中B. 2。 5主要仪器 1 PCR 仪。 5.2台式低温高速离心机。 3电泳仪、水平电泳槽。 5.4凝胶成像仪。 5 微量移液器（0? 5 L?10 L、10 L?100 L、20 L?200 L、100 L?1 000 L)。 6灭菌锅等。 6操作步骤 1对照的设立 实验分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照（即用等体积的DEPC水代替模板RNA做空白对 照），在检测过程中要同待测样品一同进行如下操作。 6.2样品制备 取马铃薯试管苗、块茎芽眼及周围组织或茎叶组织〇. 05 g?0. 1 g，现用现取或4°C条件