核酸的分离与纯化教材.ppt

从哺乳动物细胞制备大量mRNA 时，是首选方法，提取的mRNA量可达总RNA的1%～10%。 缺点是分离速度慢，柱易堵塞，不适合同时对多个标本的处理，而且很难回收全部的poly(A+) RNA，故不适合对少量RNA样品的分离纯化。 整个过程必须防止RNase的污染，可将总RNA溶液65℃中温育再冷却至室温后上样，这样可破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA的poly(A)尾处的二级结构被破坏后，可使poly(A+)充分暴露，提高回收率；同时也能使mRNA与rRNA解离，减少rRNA污染。 oligo(dT)-纤维素柱可在4℃储存并反复使用。 2、oligo(dT)-纤维素柱离心法 该法克服了oligo(dT)-纤维素层析柱法流速慢、易堵塞等不足，通过一系列可离心的分离层析柱，达到快速制备的目的。该法适用于多个样品的批量处理，具有快速、产量高及质量好等优点，制备的mRNA可用于Northern杂交、RT-PCR及体外翻译。 3、oligo(dT)-纤维素液相结合离心法 不经填柱，而是直接将oligo(dT)-纤维素加入到一系列的含不同RNA样品的微量离心管中，通过离心收集吸附有poly(A)+RNA的oligo(dT)-纤维素，经漂洗后，用含70%的乙醇洗脱液将吸附的poly(A)+RNA从oligo(dT)-纤维素上洗脱并沉淀出来。 该法可同时批量处理多个样品，而且能从少量的RNA样品中分离出poly(A)+RNA。 用本法分离poly(A)+RNA时，应选用等级较高的oligo(dT)-纤维素，如oligo(dT)18-30纤维素，而一般的柱层析填充的是oligo(dT)12-18纤维素。 4、磁性球珠分离法 联合利用了oligo(dT)与poly(A)的互补配对特性、生物素与链亲和素的特异性结合以及磁性分离原理，对poly(A)+RNA进行高效、灵敏、快速的分离。 其产量提高，回收率高达70%~100%，且分离的mRNA所含残余杂质大大降低，具有更高的纯度。 能用于几乎所有的分子生物学实验。但它对组织或细胞的最大处理量每次不超过1克，而且磁珠很贵并需要专门的磁性分离架。 5、其他方法 包括poly(U)-凝胶层析法及poly（U）-滤纸法。Poly（U）-凝胶层析法利用poly（U）与poly(A)的互补配对原理。 思考题： 1. 在核酸的分离和纯化过程中，如何保持核酸的完整性？ 2. 试述举2种质粒DNA提取的方法及应用。 3. 简述哺乳动物细胞基因组DNA抽提的主要方法有哪几种？ 4. 简述从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的主要方法有哪几种？ 5. 简述磁性球珠分离法分离mRNA的原理。 ? 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * RNA 污染可致DNA样品的比值高于1.8，故比值为1.8的DNA溶液不一定为纯DNA溶液，可能兼有蛋白质、酚和RNA的污染。 A230/A260的比值应为0.4~0.5，若比值高说明有残余盐存在。 溶解RNA样品的pH会影响比值。 总RNA中，rRNA最多，占80%~85%，tRNA 、snRNA占15%~20%，mRNA占1%~5% 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 小规模的第一链合成 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * EDTA可络合Mg2+、Ca2+等二价金属离子，能有效抑制DNase活性。 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * RNA酶抑制剂或有机溶剂的加入仅是一种暂时保存的需要，如果对后续的研究与运用有不利影响，则应予以去除。 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * （三）DNA片段的回收 主要是从电泳中分离回收DNA片段。 回收原则：尽量提高回收率； 去除回收DNA样品中的杂质。 1、DNA片段回收的原则和要求 （1）回收率 提高DNA样品的上样量，减少回收体积。 （2）纯度 回收的DNA样品常因支持介质的不纯、回收溶液的使用及操作不慎等因素而引入杂质，这些杂质可能严重影响后续的实验。 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法。 其中柱层析法采用阴离子交换层析的原理，主要是利用带负电荷的DNA在低离子强度的缓冲液中与阴离子交换树脂结合，洗去杂质，然后再用高离子强度的缓冲液洗脱下来。 上述两种纯化方法以及其它回收DNA片