核酸分子杂交技术教材.pptVIP

核酸杂交 一、DNA变性与复性 第二节 探针 基因组DNA探针 寡核苷酸探针 优点：①可根据需要合成相应序列； ②探针短,序列复杂性低,分子量小， 因此杂交时间短; ③长 度只有10—50bp，该识别序 列内1个碱基的变化可明显降低杂交Tm值。 ④可大量合成，价格低，能够用酶 学或 化学方法进行非放射性标记。 第三节 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固相杂交 southern印迹杂交 northern印迹杂交 斑点杂交　 原位杂交 液相杂交 2.Southern印迹的常用方法 毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上 电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。 （五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA （六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针 二、Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA 三、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量 四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交 * * 核酸分子杂交技术第一节 核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。 + （一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性 2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。 （二）复性 定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。 二、影响杂交的因素 1. 核酸分子的浓度和长度 2. 温度：比Tm低25℃~30℃较适宜 3. 离子强度：离子强度↑→杂交反应率↑ 4. 杂交液中的甲酰胺 甲酰胺能降低核酸杂交的Tm， 含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42℃。 使用甲酰胺的优点： ①低温下探针更稳定； ②能更好地保留非共价结合的核酸。 5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺