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第七章 基因治疗 7.1 基因治疗的概念和策略 7.2 基因治疗的载体 7.3 重要疾病的基因治疗 7.1 基因治疗的概念和策略 以DNA和RNA为诊断材料，利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，检测基因结构及其表达水平是否异常，从而对疾病作出诊断的方法。 1、内源基因的变异 2、外来生物的入侵 基因诊断常用技术 核酸分子杂交： PCR： 生物芯片： DNA芯片或基因芯片 基因测序： 血友病A基因诊断 病因：factor VIII 基因缺陷（碱基取代、缺失或插入等），使凝血因子VIII 无活性或不稳定，导致凝血障碍。 PCR扩增因子VIII基因 的18号外显子142 bp片段 Bcl I 限制酶：酶切位点在 基因内18号外显子3′端 电泳染色,分析片段的 家系分布,作出产前诊断 基因治疗（gene therapy） ：指以正常的基因替代或修补病人细胞中的缺陷基因从而达到治疗疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的手段之一。（狭义） 广义：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。 基因治疗的发展 美国，世界上开展基因治疗最早的国家。1990年9月14日，第一例正式批准的基因治疗实验开始进行，4岁ADA缺陷病人 2009年，佛罗里达大学三位患有Leber先天性黑矇(LCA)2型的遗传性盲患者 中国：1991年7月开始进行基因治疗临床实验，血友病B，Ⅸ因子治疗后浓度上升，出血症状减轻,取得了安全有效的治疗效果。 基因治疗： 生殖细胞(germ cell)基因治疗 体细胞(somatic cell)基因治疗：骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞等，随机整合 7.1.1 基因治疗的途径与策略 基因治疗途径： 体外基因治疗（ex vivo）：是将含外源基因的表达载体导入人体自身或异体细胞，经体外细胞扩增后输入人体。 体内基因治疗（in vivo）：是将含外源基因的真核细胞表达载体直接导入人体内。 已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病扩大到获得性疾病。 基因治疗的总体策略 1、基因矫正（修正）（gene correction）：未实现 2、基因置换 （gene replacement）： 3、基因修饰（增补）（gene augmentation）： 4 、基因激活（gene activation）： 5 、基因失活（干预）（gene interference ）：反义核酸、核酶、RNAi 6 、药物敏感疗法：“自杀基因”的应用：旁观者效应 7 、免疫基因治疗 8、耐药基因治疗 7.1.2 基因治疗基本程序 ①基因诊断：利用多种基因检测技术如限制性片段长度多态性分析（RFLP）、PCR扩增靶序列法和人类基因库搜寻法等对人体病变基因进行定位。 ②基因分离：指利用DNA重组技术克隆、鉴定、扩增和纯化用于治疗的基因，并根据病变基因的定位，与特异性整合序列和基因表达调控元件进行体外重组。 ③载体构建： 病毒型载体：腺病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、反转录病毒载体等，它是基因治疗中使用的主要载体； 非病毒型载体：脂质体载体和多聚阳离子载体等。 ④基因转移： 体内疗法：病毒颗粒直接注射法、重组DNA分子直接注射法、呼吸道吸入法、基因枪转移法和电穿孔法等。 体外疗法：病毒转染法。 7.1.3 基因治疗的现状与问题 恶性肿瘤 64.6%，心血管8.9%，艾滋病7.9% 美国63.4%，欧洲27%，日本与澳大利亚1.1%和1.8% 基因治疗－－理论和技术上的挑战 1.缺乏更多更好的治疗基因： 2.缺乏高效特异的基因导入系统：转移效率、特异性 靶向载体 3.治疗基因表达缺乏可调控性：包括空间上的可调控性和时间上的可调控性。 4.表达水平低 5.随机整合带来的问题 7.2 基因治疗的载体 7.2.1 逆转录病毒载体 7.2.2 腺病毒载体 7.2.4 单纯疱疹病毒 7.2.1 逆转录病毒载体 正链RNA病毒 5’ gag- pol- env 3’ (编码核心蛋白)(逆转录酶)(编码病毒包膜蛋白) 病毒感染细胞后，逆转录成双链DNA，整合在染色体上，以此合成病毒基因及RNA，装配成病毒颗粒。 逆转录病毒载体优点： 1、基因组小而简单，可随机整合 2、感染效率高 3、侵染范围广 4、原病毒稳定拷贝数低 5、对宿主细胞无毒副作用 6、10 kbDNA 缺点： 1、仅转染分裂期细胞；2、随机插入的风险 ADA-Gene + vector （逆转录病毒） 重组分子 患者T Ly C IL-2