基因敲除技术解说.ppt

Company name Company slogan here Company name Company slogan here WWW.COMPANYSITE.COM | INFO@COMPANYSITE.COM | +12 34 567 890 | LONG STREET 12345, CITY, COUNTRY Company name Company slogan here Company name Company slogan here WWW.COMPANYSITE.COM | INFO@COMPANYSITE.COM | +12 34 567 890 | LONG STREET 12345, CITY, COUNTRY 基因定点敲除技术 * 概念 基因敲除(knockout)技术是20世纪80年代发展起来的。是指一种遗传工程基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。 * 1.锌指核酸酶(ZFNs) 2.TALENs 3.CRISPR-Cas9 * 1、锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFNs) 又名锌指蛋白核酸酶，不是自然存在的，而是一种人工改造的核酸内切酶(图1)，由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶赋剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。 图1. 结合到DNA(橙色)上的锌指核酸酶(蓝色)，图片来自维基共享资源，Thomas Splettstoesser * 结构 * 利用ZFNs进行基因打靶的试验步骤 （1）确定ZFN靶位点的DNA序列 （2）设计和选择可识别靶位点的锌指蛋白( ZFPs) （3）利用已选择和设计的锌指蛋白组装ZFNs （4）单独将ZFNs转入正常细胞诱导目标基因发生DSB，则可激活NHEJ修复机制，或许将ZFNs和与目标基因同源的供体DNA一同转入正常细胞，则可以激活HR介导的DSB修复机制，并产生出变异群体 （5）检测与研究供体DNA模板在特异位点所引起的基因变异与基因修复情况 （6）还需要通过Southern杂交来检测供体DNA序列并没有整合到细胞基因组的其他位点 * 2005 利用农杆菌介导转基因拟南芥的研究，NHEJ修复ZFNs引起的DSB在植物基因工程中应用的可能性 2005 Wright 等在烟草中利用ZFNsHR诱发DSB，证明了HR修复ZFNs引起的DSB在植物基因工程中应用的可能性 2009 Maeder等首先利用NHEJ修复了由ZFNs介导的烟草SurA和SurB的基因敲除 2009 Townsend等利用HR修复机制对SurA和SurB的基因进行了操作 2009 Cai等利用ZFNs对烟草的CHN50基因进行了操作，他们利用HR介导的修复机制把PAT基因转入CHN50序列中 2009 Shukla等利用HR修复通过插入PAT基因来敲除玉米的IPK1基因，得到了插入PAT基 因并使 CHN50基因敲除的玉米材料并研究了该基因敲除后的植物代谢表现 2011 Shaun等利用CoDA设计了8对ZFNs靶向操作大豆基因组中的独立基因与重复基因对 2010 Osakabe设计了针对ABA-INSENSITIVE4( ABI4) 基因的ZFNs，并用农杆菌介导转入拟南芥植株，最终得到了ABI4基因敲除的纯合个体，具有对ABA和葡萄糖不敏感的表现型 2010 Zhang等设计了针对ADH1和TT4的ZFNs，并构建了雌性激素诱导表达的载体系统 * 锌指核酸酶ZFNs在植物基因组定点改造上的可能前景，但由于ZFNs的合成组装技术难度大，一般实验室难以实施，而且ZFNs易于对基因组进行非特异性切割，或对靶点DNA切割效率低，一直限制其进入实际应用 ZFNs的优缺点： * 2009年，Boch等和Moscou等关于黄单胞菌效应子蛋白TAL效应子（transcription activator-like effector）与寄主靶基因DNA特异性识别分子密码的破解，使植物基因组定点改造呈现出新的曙光。 2011年8月来自Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，并成功敲除了人类细胞靶向基因和调控内源性基因的转录。 2013年，首尔国立大学化学系和国家基因工程创新举措研究中心的Kim课题