基因转化方法与转基因植株鉴定解说.pptVIP

基因导入方法: 三、电击法 (Gene transfer by electroporation) 四、花粉管通道法 花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道（ 又叫花粉管引导组织），经珠心通道，将外源DNA 携带入胚囊，转化受精卵或其前后的生殖细胞（ 精子、卵子），由于它们仍处于未形成细胞壁的类似“ 原生质体”状态，并且正在进行活跃的DNA 复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA 片段整合到受体基因组中，以达到遗传转化之目的。 该方法可用于任何开花植物，将供体总DNA的片断，在受体自花授粉后一定时期涂抹于柱头上，使能沿着花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后的细胞。实际应用时一般切除柱头进行涂抹，这样可减少DNA 进入胚囊的距离，提高转化率，但会影响结实率。 转基因植物的鉴定 转基因植物的鉴定 遗传鉴定 表达鉴定 表型分析鉴定 利用报告基因 Northern 杂交 Western 杂交 直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上。 1）扩增目的片段； 2）杂交信号鉴定。 （Southern 杂交） 检测拷贝数 一、Southern blot检测 Southern blot 制作探针： ----- 根据试剂盒的要求确定DNA用量， 一般不超过100ng. ------ 反应结束后对探针最好用层析柱进 行纯化 -----不同的植物用于Southern杂交的DNA量不同，一般每泳道的拟南芥DNA的用量为10-25ug. -----一般用高于酶切需要量DNA的10倍酶量，DNA的浓度不要过高。注意不同的酶要求的反应温度不一样。 -----酶切后取少量样品检测酶切是否完全，如果不完全，可加酶后继续酶切。 DNA酶切 根据酶切后的目的片断大小，一般采用0.7或0.8%的agarose。但当酶切后目的片断较小时，要适当提高胶的浓度。记住电泳时两边的泳道要加标准分子标记。 电泳是电压不要过高， 一般为1v/cm。最好电泳完毕后进行染色。 电泳完毕要用比例尺对胶进行照相。 DNA凝胶电泳 对胶的后处理： 如果片断较大（〉15kb)，凝胶需在0.2M HCl中处理10分钟 用水漂洗凝胶，加入1.5M NaCl, 0.5M NaOH,处理45分钟，并轻轻摇动。 用水漂洗凝胶，与1M Tis-HCl,(pH7.4),1.5M NaCl,轻轻摇动，中和15分钟， 一般用尼龙莫 一般实验室多采用毛细管法 转膜缓冲液一般为10X的SSC或SSPE, 转膜时间一般为48hr。用UV确认转膜是否完全。 固定： UV 0.4M NaOH, 80oC烘烤1.5-2小时 转膜 Upward capillary transfer 5-8cm 400g 二、 Northern blot 从植物中提取RNA 方法1. 热酚法 试剂： 提取缓冲液： 100mM LiCl 1%SDS 100mMTris-HCl (p8.0) 10mMEDTA TE缓冲液饱和酚 氯仿 4MLiCl 乙醇 75%乙醇 300mM醋酸钠（pH5.2) 0.05%DEPC H2O (1LH2O中加入0.5ml DEPC, 摇动混合4小时以上，120oC, 灭菌30分钟） 20XMOPS: 0.4M MOPS 0.1M CH3COONa 0.02M EDTA pH 7.0 ---500ml 20XMOPS 中，加大约 5.5克KOH后，慢慢调至pH7.0. 120oC, 灭菌45分钟. 37%甲醛 甲酰胺（-20oC保存） 30%过氧化氢 试 剂 10mg/ml EtBr 10XDye: 50% Glycerol, 1mMEDTA, 0.4%溴酚兰， 0.4%二甲苯青FF, 用DEPC处理水调制 20XSSPE or 20XSSC, -----电泳槽用5%过氧化氢处理2个小时以上，DEPC处理水清洗2次。 -----灭菌、RNA专用瓶中加入80mlDEPC处理水及1.2克琼脂糖，微波炉加热溶解，60oC水浴上放置15分钟，加入5ml20xMOPS及15ml甲醛溶液，灌胶。与通风橱中进行。 变性凝胶制备 ----RNA加样缓冲液： 35ul 37%甲醛 100ul 甲酰胺 5ul 20XMOPS 20ul 10xDye 合计 160ul ----- 4ul RNA样品（ 4ul DEPC或甲酰胺中溶解 10-20ugRNA） ----- 加入16ul RNA加样缓冲液，混合 ----- 65oC加热10分钟 ----- 冰中放置5分钟 电泳用RNA样品的准备 ---- 把制作的凝胶置于电泳槽中，加1XMOPS 缓冲液