Talen康为世纪解说.ppt

* * 新的里程碑：TALEN靶向基因敲除 北京康为世纪生物技术有限公司 客服技术部 王春香 博士 执行董事兼总经理 ?北京大学生物系学士和硕士学位 美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）病理系博士学位。 1999年回国 2002年创办北京天为时代科技有限公司 2005年被QIAGEN收购 - 天根 2007年底创建康为世纪 目标：成为中国的Invitrogen 北京康为世纪生物科技有限公司 康为世纪生物科技有限公司 完善的产品线 分子生物学 全系列产品 蛋白生物学产品 免疫学相关产品 一站式服务平台 实验设计平台 分子生物学平台 蛋白表达与纯化 平台 抗体制备纯化平台 免疫学检测平台 北京康为世纪生物科技有限公司 我们的客户 我们的合作伙伴 北京大学、清华大学、 复旦大学 中国科学院、军事医学 科学院 301医院、协和医院、 上海瑞金医院 华大基因、诺华制药 江苏泰州中国医药城 临床诊断试剂研发及中试平台 3000平米实验室及GMP厂房 崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 - 基因敲除（Knockout） 什么是基因敲除 - 通过某种方法将一个特定的目标基因破坏，使其失去原有的功能。 为什么要做基因敲除 - 基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一。 寻找、证明-证明一个基因的功能都需要哪些步骤？ 崭新的技术解决经典的挑战 科研论证基本法则 科霍法则 （Koch‘s postulates ） 如何证明某种微生物导致了某种疾病？ 该种微生物存在与患病个体而不存在于健康个体。 该种微生物可从患病个体上分离出来并体外培养。 当把该种微生物接种入健康个体体内时可使健康个体患病。 从人为接种的患病个体中又可分离得到该种微生物。 Robert Koch 1843 – 1910 科研论证基本法则 Falkow的分子科霍法则（Falkow’s molecular Koch‘s postulates） 如何证明一个基因编码一种毒力因子？ 该基因存在于毒力菌株，而不存在于无毒菌株。 当该基因被敲除时菌株毒力消失或下降。 当该基因被补回（敲入）突变菌株时毒力得到恢复。 Reverse genetics 基因敲除是证明基因功能不可缺少的逻辑环节 基因敲除是基因工程和基因治疗的重要手段 为什么要做基因敲除？ 怎样做基因敲除？ 经典方法 ：自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！ 革命性的进步：RNAi – 临时性，不完全敲除 – Knockdown 饱含希望与失望的技术：ZFN 新的里程碑：TALEN TALEN技术 基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理： 1989年，植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.）avrBs3 基 因被克隆。 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 - TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 17 -18个34aa重复序列 34aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对应识别一个目标碱基 TALEN 发展过程 2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 一篇综述 《Move over ZFN》 TALEN的最前沿 TALEN基因敲除基本流程 确定靶点：选择目标基因外显子中相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点 2. TAL靶点识别域的克隆构建 3. 将TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体以表达重组核酸酶