第八章分子生物学研究方法下教材.ppt

一、原位杂交技术 原位杂交（In situ hybridization,ISH) 是用标记的DNA或RNA为探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 通常可分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。 RNA原位杂交： 用放射性或非放射性标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析。 染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术。 目前发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。 1、酵母单杂交法 2、酵母双杂交系统 三、RNA干扰技术(RNA interference，RNAi) RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。 四、 基因芯片及数据分析 DNA芯片(DNA chip)，又称DNA微列阵(DNA microarray)，是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固体介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质和其他生物成分的快速、高效、敏感的处理与分析。 2、基因芯片的主要制作过程: 1、经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段； 2、用机械手将PCR产物点到玻璃片了，变性固定； 3、分别从不同组织或器官中分离 mRNA ，反转录生成cDNA； 4、分别用两种不同的荧光染料标记两种cDNA； 5、将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交； 6、激光扫描芯片杂交结果，计算机处理； 7、分析杂交数据。 根据基因芯片的用途可分为: 五、其他分子生物学技术 1、凝胶滞缓实验 2、噬菌体展示技术 噬菌体展示技术的原理： 将编码“诱饵”的DNA片段插入到噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因融合。该重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。 总 结 一、原位杂交的概念及分类 二、酵母单杂交法原理 三、酵母双杂交系统的原理 四、 RNA干扰技术的原理 五、 基因芯片技术的原理 六、凝胶滞缓实验的原理 七、噬菌体展示技术的原理 * * 第八章 分子生物学研究方法(下) 染色体原位杂交 染色体专一位点探针 转录因子cDNA 酵母转录激活域 酵母细胞 表达载体 导入 转录因子表达 顺式作用元件 启动子 报告基因 报告基因是否表达？ 二、 蛋白质及RNA相互作用技术 转录激活因子 DNA结合结构域 转录激活结构域 (binding domain,BD) (Activation domain,AD) 将编码已知蛋白的DNA序列连接到能够表达转录因子DNA结构域的载体上，使之表达融合蛋白。 靶蛋白 DNA结合蛋白 报告基因 启动子 DNA结合蛋白 诱饵 编码转录激活域的DNA 待筛选cDNA文库片段 猎物 猎物与诱饵共同在酵母细胞中表达，假如猎物载体中表达的蛋白有与靶蛋白作用的蛋白，这时转录因子的结构域与激活域就会靠拢，激活报告基因表达。 总之，通过判断报告基因是否表达，来分离与已知蛋白作用的新基因。 放大作用 DICER：核酸酶 RNA诱导的沉默复合体（RNA inducible silent complex ： RISC) 阻断靶基因表达 RNAi的生物学功能： RNAi的本质是一种由RNA介导的序列特异性的获得性免疫反应，是一种原始的基因组对抗外来基因表达的保护机制，是生物体在基因组水平上的免疫系统。 线虫体内的RNAi 线虫中RNAi效应的检测 （左面）两条线虫表现为绿色荧光蛋白（GFP）表达类型品系，该品系含有一个普遍性表达的GFP报告基因重组质粒（带有核内定位信号位点）。 （右面）喂食表达争对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体的GFP信号消失。 1、基因芯片技术原理 基因芯片的制作原理 按基因芯片点阵的制备方法，基因芯片可以分为： 原位合成芯片（synthetic genechip） 适用于寡核苷酸。根据预先设计的点阵序列在每个