高产细菌素乳酸菌的筛选.pptxVIP

高产细菌素乳酸菌的筛选 导语乳酸菌是在食品发酵工业中广泛应用的益生菌,它可以抑制或杀死一些病原菌和食物腐败菌。近年的研究表明乳酸菌能分泌产生一种或多种抑菌物质细菌素,具有高效、无毒、无残留、无抗药性等优点,已成为食品生物防腐研究的重点,同时被认为是抗生素最有效的替代物。因此要筛选出高产细菌素的乳酸菌菌株,并对筛选菌株的发酵培养基进行优化,以期得到最大抑菌活性的细菌素。此实验以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌,从多种材料中筛选具有较高抑菌活性的乳酸菌,对可能产生高效抑菌活性的乳酸菌来源进行探索。细菌素——由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽。作用：1.抑制DNA酶或RNA酶 2.通道形成穿膜蛋白，使膜去极化乳酸菌 lactic acid bacteria，LAB定义：发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。作用机理：乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、酸菌素等物质具有特殊生理功能，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、免疫反应和应激反应等产生作用。乳酸菌素是乳酸菌在代谢过程中，合成并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性菌，尤其是亲缘较近的细菌具有抑菌作用的杀菌蛋白或多肽乳酸菌素(?Nisin)?是乳酸球菌代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的物质。作为乳酸菌细菌素，许多证据表明，Nisin对细胞主要作用在细胞质膜，而对细菌的杀菌作用是由于在菌膜上形成空洞，使膜的通透性增大。实验前的准备工作一.材料与试剂? 泡菜?大肠杆菌、金黄色葡萄球菌?碳酸钙（3%)30g、1mol/L?NaOH溶液、1mol/LHCl溶液、pH试纸、木瓜蛋白酶、双氧水二.培养基1、MRS培养基:?蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温80?1mL、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18g、蒸馏水1000mL。2、牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3.00g、蛋白胨5.00g、NaCl3.00g、蒸馏水1000ml、琼脂粉8.00g、115℃灭菌20min?。3、石蕊牛奶培养基：牛奶培养基(牛奶培养基的制备取脱脂奶粉，制成10%的溶液)?，每100ml中加入2.50ml石蕊乙醇溶液(?取石蕊20g，研磨后置锥形瓶中，加入40%乙醇150ml，煮沸1min，倒出上层液，再加入40%乙醇150ml，煮沸1min，倒出上层液，与第1次倒出液合并，再以40%乙醇加至全量为300ml，滴加1mol/L?盐酸，随加随振摇，至溶液变紫色为止,pH6.0~8.0，混匀，取5~10ml分装于试管中，115℃灭菌20min。三.实验器材平皿，试管，锥形瓶，移液（1ml,5ml,10ml）,洗耳球，容量瓶，试管架，酒精灯，超净台，烧杯，牛津杯，无菌滴管，水浴锅，玻璃棒，电炉，离心机，镊子，滤纸，天平电热恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电热恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱四.实验步骤吸取酸菜水1ml，加入装有9ml无菌水的试管中，振摇均匀，制成稀释度为10-1菌悬液。在无菌条件下，用无菌吸管吸取菌悬液1ml，加入到9ml的无菌水中，制成的10-2菌悬液，依照上述操作按10-3、10-4、10-5??的稀释倍数将样品稀释。抑菌乳酸菌的初筛吸取不同浓度菌悬液1?ml?接种到有碳酸钙的MRS?固体培养基上，30?℃培养18?h。挑取有碳酸钙溶解圈的过氧化氢阴性菌落，然后接种在固体MRS平板上，每皿点种6?个，培养24?h?后，长出圆形的菌斑，冰箱保存待用。将指示菌在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养20h，取该菌悬液0.1?ml，与5.0?ml?经熔化后保持在45?℃左右的牛肉膏蛋白胨固体培养基混和均匀后，立即倒入上述接有被检验菌的平板上，37?℃培养12?h，根据被检验菌斑周围是否形成抑菌圈来判断被检菌抗性物质的产生。将能够产生抑菌圈的被检菌株接种在5.0?ml?的MRS?液体培养基中,30℃培养18?h，在MRS?固体培养基上划线分离，进行纯化，挑取单菌落进行镜检。乳酸菌的鉴定?将菌种接种到5?～?10?ml?的石蕊牛奶培养基中，在37?℃培养48?h，石蕊应被还原为无色，牛奶应呈正常凝固现象，培养基上层表面应呈紫红色环。