细胞生物学常用技术1.pptVIP

3.双向电泳 根据蛋白质分子量、等电点分离 等电聚焦: 等电点 SDS: 分子量 4.Western 印迹技术 将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸 纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定 蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗 或生物素标记二抗反应,最终以发色底物显色而 被检测. 基本步骤: (1)SDS(2)转膜 (3)抗体反应 一抗孵育 标记二抗孵育 (4)显色 western blotting 三、细胞培养技术 （Cell culture） 从活体组织中分离出特定的细胞，在一定的 条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以 至增殖的方法 in vitro 用培养细胞做实验 in vivo 用动物做实验 1.细胞培养的条件 (1) 固体表面：培养瓶、培养皿 (2)培养基 常见培养基：1640 DMEM (3)无菌 无菌操作：超净工作台、火焰消毒等 培养液中加入抗菌素 器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤） (4)其他 温度 37℃ 湿度 100% CO2浓度 5% 2.细胞培养的传代 原代培养:直接取材于有机体的细胞培养 取材 切割 消化 培养 传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中 取出，以1:2以上的比例扩大培养 原代培养 传代培养(保持分化特性) 传代 3.细胞系（Cell line） 在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无限繁 殖能力，能够无限传代的细胞群。 变异细胞 细胞系 HeLa 人宫颈癌上皮细胞 3T3 小鼠成纤维细胞 无限繁殖 相差显微镜观察培养中的HeLa细胞 4.细胞融合（Cell fusion） （1）定义 在自然或人工条件下，使二个或二个以上 细胞合并形成一个细胞的过程。 异核体 杂交细胞 分裂 （2）促融方法 生物学方法：仙台病毒 化学方法：PEG 物理方法：电脉冲打孔仪 （3）应用 A 细胞核和细胞质 间的相互作用 B 膜蛋白的流动性 C 基因定位 D 单克隆抗体制备 B 淋巴细胞 肿瘤细胞 Mouse cell Human cell division E 细胞周期相关因子的发现 四、细胞组分的分级分离 通过逐级分离对细胞内细胞器和各种成分的 化学性质和功能进行研究的方法。 匀浆 分级分离 分析 匀浆液 膜 细胞器 大分子 低渗 超声 去污剂 强制过滤 研磨 细胞 破坏 （一）离心法 用于分离细胞器和大分子 配平 低温 1.差速离心法 分离对象:不同大小和形状的组分 （细胞核、细胞器） 具体方法:由低速到高速逐级沉降 (repeat) 2.速度沉降法 分离对象:不同大小、形状的组分(沉降系数S) 比差速离心方法更精细 具体方法: 在离心管中予装5%-20%蔗糖梯度的离心介质 3.平衡沉降法 分离对象:密度不同的组分（与大小、形状无关） 具体方法：在离心管中予装一定密度梯度的离 心介质（20%-70%蔗糖、CsCl） 通常采用超速离心 （二）层析法（柱层析） 主要用于分离、纯化蛋白质 填充柱 填料（固定相） 流动相 1.离子交换层析 层析介质:阴离子或阳离子树脂 分离原理:电荷