Western印迹技术材料.ppt

Western印迹 实验目的 实验原理 Western印迹杂交法是利用特异性抗体做探针，对附着于固相支持体上的某些特异性蛋白进行鉴别和定量的方法。它具有固相操作简便及不必对细胞进行放射性预标记等优点。原理为：将待测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白变性并分离，用电转移方法转移到固相支持体上（NC膜、PVDF膜），滤膜与抗靶蛋白的非标记抗体反应，再用二级免疫学试剂进行检测。检测方法有放射性标记、酶标化学显色或酶标化学发光等。酶标化学发光法以其高敏感性、结果可在X光片上长期保存等优点而优于酶标化学显色法。 是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。 原理及步骤 T or cell 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白（SDS) 转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质 Western Blot Western blot 生物素 HRP 化学显色复合物 ABC复合物 组织抗原 抗生物素 一抗 生物素化二抗 抗HRP 实验材料 1．29:1聚丙烯酰胺凝胶 2．Tris-甘氨酸电泳缓冲液： 25mM Tris 碱 250mM 甘氨酸 0.1%(m/v) SDS 3．1×SDS凝胶加样缓冲液： 50mmol/L Tris-Cl (pH6.8) 100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） 2% (m/v) SDS 0.1% (m/v) 溴酚蓝 10% 甘油 临用前加DTT，DTT可用0.01M 乙酸钠（pH5.2）配成1mmol/L母液。 4．转移缓冲液： 25mM Tris 碱 193mM 甘氨酸 20% 甲醇 5．1×TBS： 20mM Tris-HCl 150mM NaCl 最后调pH值至7.4 6．TBST: TBS中加入0.05% Tween-20。 7．封闭液：用TBST配制5%脱脂奶粉。 8．Stripping Buffer： 100mM β巯基乙醇 2%(m/v) SDS 62.5mM Tris-HCl 最后调pH值至6.7 方法和步骤 一．配胶 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度。 灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。 待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。 灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 二．样品处理 1．培养的细胞（定性）： ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵ 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~