生物：专题5.3《血红蛋白的提取和分离》课件(新人教选修1)08.ppt

透析过程动画演示 利用透析袋透析 3.纯化 实现途径： 4.纯度鉴定 (1)方法： （2）原理： 凝胶色谱法 电泳（常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳） 通过电泳区带位置的比对，确定蛋白质的纯度或相对分子质量。即选用一组已知浓度的标准蛋白（或相对分子质量）的标准蛋白质与需要鉴定的蛋白质同时进行电泳，通过比对二者电泳的区带位置，确定需要的鉴定的蛋白质的纯度（或相对分子质量） 蛋白质的提取和分离 （三）凝胶色谱制作 1.凝胶色谱柱的制作 　　①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作： 　　打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 　　 ③顶塞的制作： ④组装： ⑤安装其他附属结构。 打孔→安装玻璃管 　　底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 注 意 2.凝胶色谱柱填料的处理 计算凝胶量 配置凝胶悬浮液 装填 洗涤平衡 　　凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 注 意 　　缓冲液液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。 注 意 装配好的凝胶柱 　　在提取血红蛋白实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 　　使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究。 思考 如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。 　　你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？ 思考 3 样品加入与洗脱 ①缓冲液缓慢下降 50cm高 ②加透析样品 注意正确的加样操作： ①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁环绕移动 注 意 3 .样品加入与洗脱 ①缓冲液缓慢下降 50cm高 ③样品渗入凝胶床：④洗脱： ⑤收集： ②加透析样品 收集得到的纯化后的蛋白 　　观察你处理的血液样品离心后是否分层？如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 　　1. 你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 三 实验结果分析与评价 　　2. 你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 　　由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 　　如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 　　3. 你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？ 　　1.与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？ 　　血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考 2.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 　　血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 教学反馈 1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度 2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度 3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（