酶切电泳回收.pptVIP

* * 实验 4 酶切重组质粒 电泳分离所插入的DNA 目 的 1．鉴定。鉴定所培养的单菌落中是否含有重组质粒，或仅含有自身环化的质粒。当酶切产物电泳后，重组成功者电泳后会出现大小不等的两条 DNA 条带，一条为线性质粒载体的 DNA，分子量大，在后面；另一条为插入的目的基因片段，分子量小，在前面。若自身环化者仅有一条载体的DNA条带。 2．收获。通过电泳分离，使载体与插入目的基因片段分离，便于分别回收载体和已大量扩增的插入目的基因片段，比如探针用片段。 本实验由 2 个部分组成： （1）酶切重组质粒； （2）DNA 的琼脂糖凝胶电泳。 ● 关于限制性内切酶 本实验选用的限制性内切酶是分子生物学中最为常用的工具酶。通常不同的限制性内切酶分别能识别一小段双链 DNA 序列，长度多在 4～6 个核苷酸，且呈双重对称的 DNA 序列，并将其切断。有粘端和钝端两种形式： EcoR I ↓ 5...GAATTC...3 → 5...G AATTC...3 3...CTTAAG...5 3...CTTAA G...5 Pst I ↓ 5...CTGCAG...3 → 5...CTGCA G...3 3...GACGTC...5 3...G ACGTC...5 Sma I ↓ 5...CCCGGG...3 → 5...CCC GGG...3 3...GGGCCC...5 3...GGG CCC...5 利用这种特性，可以选择适当的酶来切割所需的DNA 片段，或选择适当的酶切开载体，造成载体的粘端序列与插入 DNA 的粘端序列相同，以便于重组质粒。具体酶的特性、识别位点等可以参考不同公司的产品目录。 ● 琼脂糖凝胶电泳 DNA 的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中使用广泛的技术，该技术利用 DNA 分子在电场下向电场一极迁徙的特性。在 pH 中性的条件下，DNA 分子由阴极向阳极迁徙。其间，DNA 分子量大者，摩擦阻力大，在凝胶的孔隙中迁徙得慢；分子量小者，摩擦阻力小，迁徙快。在电泳一定时间后，大小不等的 DNA 分子可以得到有效得分离。同样分子量的 DNA，环状的较线性的迁徙速度快。分离的 DNA 可以用溴乙锭染色观察，方法是：（1）在灌胶时直接把溴乙锭混入凝胶，或（2）电泳后将凝胶浸入溴乙锭染液。染色后在紫外透射灯下可以看到橘红色的 DNA 条带，在一般实验室最低分辨能力（肉眼可见的）约为 50～100ng。 原 理 采用限制性内切酶 Hind III 切开插入 DNA 与质粒载体，将这一反应液上样于琼脂糖凝胶，电泳，使分子量小的插入 DNA 前移，并与分子量大的在电泳中滞后的质粒载体 DNA 分开。 实验准备 （参考教材） 实验步骤 1．酶切质粒 取一洁净的 1.5ml Eppendorf 管，编好号，插入冰中，依次加入： 水 7ul 10×缓冲液 2ul BSA 2ul 重组质粒 8ul Hind III 1ul 20ul 盖上盖，混匀，将反应物甩入管底，置 37℃ 水浴中温育 1 小时。 2．灌胶 将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。 取一烧杯，放入： 琼脂糖 0.7 g 5×TBE 10 ml 水 40 ml 50 ml 混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入 5ul 饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。 如果梳子大且角锐利，应该离模具底部远些，以防拔梳子时将凝胶底部拔穿。 3．上样电泳 将胶两头粘胶纸揭去，移入电泳槽，梳子一侧靠近操作者，注入 1×TBE 缓冲液，浸没凝胶，轻轻拔出梳子。接上电源：阳极远离上样孔，阴极靠近上样孔（DNA 向阳极移动）。 加 4ul 上样缓冲液入酶切反应液，混匀，插入冰内。加 2ul 上样缓冲液入 10ul 小量制备的重组质粒，混匀，插入冰内。 上样次序：由右向左。第1孔：5ul 标准品梯度DNA，第2孔：12ul 未经切割的重组质粒 DNA，第 3～6孔：24ul 含上样缓冲液的酶切反应