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抗原抗体反应及其应用 摘要 抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。免疫印迹，又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。双转印法、天然电泳及western blot 分析等是最近几年出现的新型蛋白印迹技术。单克隆抗体技术是20世纪后20年内最为重要的生物高技术之一。单克隆抗体药物在肿瘤治疗、抗感染等方面具有重要的作用。 关键词 抗原抗体反应、Western blotting、单克隆抗体技术 一、抗原抗体反应 抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。这种反应既可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化[1]。抗原是能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原表位是抗原上与抗体结合的区域。蛋白质抗原的表位是由相邻的连续的或非连续的氨基酸序列形成的局部表面结构[2]，如图1所示。抗体是指宿主对体内存在的外来分子、微生物或其他因子的应答而产生的蛋白质。 抗体主要由B淋巴细胞系的终末分化细胞-浆细胞产生，并且循环在血液和淋巴液中，在那里与抗原结合。 抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。抗体上与抗原表位结合的位点由重链和轻链的可变区构成[3]，如图2所示。 抗原抗体复合物通过大量非共价键连接。 某些免疫复合物中抗体或抗原的结构未发生改变，而另一些则出现巨大的构像改变。 研究抗原抗体复合物最有说服力的的方法是抗体-抗原共结晶的X射线衍射技术。 图1 抗原表位示意图 图2 抗体结构示意图 二、蛋白印迹技术 免疫印迹，又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。混合样品经ＳＤＳ-聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离,凝胶中的蛋白质用电印迹方法被转移到化学惰性的高分子转移膜上。然后,将目的蛋白的特异性一级抗体(一抗)与转移膜上的目的蛋白进行免疫结合反应,再用标记过(如HRP)的二级抗体(二抗)与一抗结合,用对二抗分子中标记物的检测证明目的蛋白的存在[4]。主要步骤如下： (1)电印迹———电转移:首先是将分离的蛋白从SDS凝胶上转印到硝酸纤维素(NC) 膜、聚偏乙烯氟化物( PVDF) 膜等固相上,PVDF 膜较NC 膜具有更高的蛋白结合性能、物理强度和化学稳定性。目前,最广泛使用的印迹方法是电转印(电转印也称电转移),即在电场作用下将凝胶上的蛋白转移到转移液浸湿的膜上。电转印又分湿转印和半干转印2种。湿转印(wet transfer) 是将整个夹心式转印体系(支持垫-滤纸-转印膜-凝胶-滤纸-支持垫) 垂直地直接浸入缓冲液内进行转印。其装置多采用Towbin 设计的垂直式不锈钢/铂电极转印槽。半干转印(semi-dry transfer)是事先将转印体系中的凝胶、膜、滤纸及支持垫浸泡在转移缓冲液中,浸湿片刻后直接进行转印,而无须将其浸入缓冲液内。具体操作为：电泳完毕后对凝胶进行半干转膜(转膜缓冲液为48 mmol/L Tris, 39mmol/L甘氨酸, 1.3 mmol/L SDS, 含20%甲醇, pH 9.2)。半干式转膜槽阴极在上, 阳极在下, 在半干转移的凝胶“三明治”中, 先准备阳极侧滤纸, 然后重叠放置两张大小完全一致的0.2 m PVDF 膜, 再铺凝胶及阴极侧滤纸, 缓冲液为连续缓冲液, 蛋白质移动方向由上而下。转移电流50~250 mA, 转移时间15~50min。半干转印优于垂直转印,因为半干式蛋白质电泳印迹具有操作简单、快速、节约缓冲液、印迹条带背景清晰等特点，而且可以一次可以转印多块胶,而且所需电压较低。但也存在一定局限性, 对于分子量过低或者过高的蛋白质的印迹效果不太理想[5]。 (2)封闭:蛋白质分子从胶上转移到膜上后,为减少探针的非特异结合,用非反应活性分子封阻转移膜上未吸附蛋白质的区域,以降低检测的背景信号。应用最多的封阻剂是脱脂奶粉,还有:凝集素、牛血清蛋白、血红蛋白、酪蛋白等。使用时应注意它们各自的特点,如:牛血清蛋白含有碳氢化合物,用外源凝集素作探针时会增加背景;用血红蛋白封闭会对膜产生“负染”。目前,对带正电荷的尼龙膜封闭时,由于尚没有有效的封剂,需要用比ＮＣ膜更加有效的封阻剂,因为尼龙膜有很高的蛋白质结合能力而