蛋白质与蛋白质DNA相互作用研究方法加实例说课.pptVIP

蛋白质与蛋白质的相互作用研究方法 蛋白质与DNA相互作用研究方法 蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法 酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down 技术 荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET） 双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC 蛋白质芯片技术 其它方法 1.1 酵母双杂交技术的原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究. 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的BD或AD都不能激活基因转录，但不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活 报告基因(reporter gene)的转录与表达。 通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物” 这两个蛋白质之间是否存在相互作用。 1.2 酵母双杂交操作主要流程 1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞 3. 对酵母转化子进行自激活检测 4. 将重组载体共转化酵母菌细胞 5. 检测报告基因表达产物 6. 分析酵母双杂交实验结果 Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex 1.4 酵母双杂交技术的优点： 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。 基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和检测实验结果。 酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命现象和规律。 4. 酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模的组学研究。 1.5 酵母双杂交技术的弱点： 1. 假阳性：自激活、多因子参与…… 假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白…… 低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况 酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括： 体外相互作用验证 体外亲和纯化（GST pull-down）、体外免疫共沉淀…… 哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀…… Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex 3.2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4oC 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 注意：该实验设立GST对照，反应均在4oC进行 3.3 GST 融合蛋白沉降实验结果 3.4 GST pull-down技术优缺点 人们在GFP基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白。 Tsien Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP和YFP分别于钙