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细胞毒性试验 2008-09-22 目的和意义 （一）目的：通过体外细胞培养技术，可检测供试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、溶解、死亡或其它毒性反应。 （二）意义：可在短期内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为体内法（动物试验）的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械和生物材料的研制和应用提供了重要保证。 细胞毒性 定义：由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。 根据欧洲标准化组织CEN1992年30号文件的定义,细胞毒性是指由产品、材料及其浸渍物所造成的细胞死亡、细胞溶解和细胞生长抑制。 细胞毒性检测 细胞形态学观察 细胞生长状态观察 细胞活性检测 指标 细胞膜对核酸染料的通透性 代谢活性 膜电位 检测：主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法： MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测 LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等 有几类细胞毒性试验方法？ 　GB/T 16886.5－2003/ISO 10993-5:1999中推荐了三类细胞毒性试验： 　1） 浸提液试验 　2）直接接触试验 　3）间接接触试验（包括琼脂扩散试验、滤膜扩散试验） 常用的细胞毒性试验方法 浸提液试验（MTT）比色法 或MTT法： 哺乳动物胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞的存活比例。该试验用于细胞毒性细定量评价。对该试验有干扰的供试品不适于本试验。 噻唑蓝比色法 噻唑蓝（MTT）比色法是目前应用最广泛的一种检验细胞活性的方法 原理：线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶解的蓝色结晶Formazan 细胞活性 琥珀酸脱氢酶活性 Formazan含量 试验材料：细胞系 　推荐使用ATCC CCL1(NCTC clone 929)[小鼠成纤维细胞]或ATCC CCL2 (Hela)[人上皮细胞]。 如能证明试验的重现性和精确性，也可选用其他细胞系。优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取。 用选定的细胞系和培养基制备试验所需的细胞。使用冻存细胞时, 如加有细胞保护剂应除去, 使用前至少传代培养一次。 试验材料：仪器 超净工作台、CO2培养箱、冰箱、倒置光学显微镜、光学显微镜、蒸汽灭菌器、液氮瓶、抽滤瓶、电热恒温水浴锅、96孔培养板、可调式微量加样器、酶标仪纯水机、液氮罐、天平、离心机等。 试验材料：耗材 培养瓶、培养板、吸管、冻存管、离心管、滤器等。 与供试品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内 121℃灭菌 20分钟。 试验材料：试剂 培养基（MEM、DMEM、RPMI1640等）、血清（小牛血清、胎牛血清、马血清等）、 消化液、抗生素液、NaHCO3 溶液、二甲基亚砜、平衡盐溶液。 　含血清或不含血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。 　 注: 培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。 试验材料：供试液与对照 供试液：应按产品标准规定制备样品浸提液。 阴性对照：选用经确认过的不产生细胞毒性 反应的材料，例如高密度聚乙烯。 阳性对照：选用经确认过的可重现细胞毒性 反应的材料，例如含有有机锡添加剂的聚氯乙烯。 试验步骤:MTT法 培养细胞直至达到其对数生长期末细胞趋于融合，用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成1×104个/mL的细胞悬液。 取96孔培养板，每孔中加入100μL的细胞悬浮液。轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表面。 c) 置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱内, 在37℃±2℃温度下培养24小时。 d) 弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性对照液，阳性对照液，100％ 和50％浓度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。 e) 置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱, 在7℃±2℃温度下进行培养。培养间期可分为24h、48h、72h。 f) 每个培养间期后,每孔加入MTT溶液20μl，置含5％二氧化碳的二氧化碳培养, 在37℃±2℃温度下培养5小时。 g) 弃去孔内液体，每孔分别加入200μl DMSO，将培养板放置10分钟，水平振摇使孔内溶液颜色均匀。 h) 用酶标仪测定吸光度，可采用双波长测定，选用的波长可为570nm和630nm。 i) 结果计算： 细胞存活率% Cell 0 10 20 40 60 80 100 测试孔 0.634 0.5552