TALEN基因修饰技术.pptxVIP

TALEN基因修饰技术TALEN技术的基本原理？TALE(TranscriptionActivator-LikeEffector)是由植物致病细菌Xanthomonas分泌的一类具有转录激活功能的蛋白，该种蛋白通过其内部保守的重复氨基酸序列（即DNA结合域）与植物宿主基因启动子区的相应核苷酸序列发生特异性结合，并激活基因表达。TALE的DNA结合域由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成，每个模块一般包含33~35个氨基酸（aa），其第12,13位氨基酸种类可变且决定了TALE与DNA结合的特异性。因此称这种重复可变的双氨基酸序列为RVD(RepeatVariableDiresidue)。TALEN(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease)是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALE的DNA结合域与限制性内切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA结合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合，因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造，是一种非常有效的基因组改造工具酶利用TALEN进行基因组编辑的原理TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂（DSB，Double-StrandBreaks），从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制（NHEJ,Non-homologousEndJoining）修复DNA。NHEJ修复机制并不精确，极易发生错误（缺失/插入），从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。(Fig.1-TALEN原理)3.2011年，首次把TALE与FokI结合在一起组成TALEN,并证实了TALEN在靶基因操作中的能力2012年，我国科学家施一公带领的团队通过解析TALE蛋白的晶体结构，清晰地揭示了TALE蛋白特异识别DNA的机理……2011年，把C端的转录激活子替换为FokI核酸内切酶，首次实现了TALE蛋白的人工改造，并显示具有良好的效果。FokI核酸内切酶切割DNA无序列特异性，FokI通常需要以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能：FokI核酸内切酶切割DNA无序列特异性，FokI通常需要以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能：TALEN技术的起源？一、TALENs的发展1989年，人们发现了TALE蛋白家族的第一个成员AvrBs3TALE蛋白类似于真核生物的转录因子，可以通过识别特异的DNA序列调控宿主植物内源基因的表达，从而提高宿主对该病原体的易感性。2.2009年，揭示了TALE蛋白特异结合宿主基因启动子的机制TALE的结构：TALEN：Transcriptionactivator-likeeffectornuclease类转录激活因子效应物核酸酶N端转运信号AD：转录激活结构域C端核定位信号介导其与DNA特异识别与结合的结构域重要3.2011年，首次把TALE与FokI结合在一起组成TALEN,并证实了TALEN在靶基因操作中的能力2012年，我国科学家施一公带领的团队通过解析TALE蛋白的晶体结构，清晰地揭示了TALE蛋白特异识别DNA的机理……TALEN技术如何进行人工构建？TALEN技术的基本流程？影响TALEN技术成功的因素？TALEN技术的应用范围？