02 革兰氏染色法.pptVIP

实验二 革兰氏染色法 一、目的 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性 学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法 二、原 理 　革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。 当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。 革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 三、??材料 ?菌种 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌及一未知菌种 染色剂 结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。 ?仪器或其他 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。 四、 实验步骤 涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检 初染 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min?，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。 镜检 干燥后，用油镜观察。 菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+）； 菌体被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。 五 实验结果 记录三种细菌（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌及未知菌种）观察结果，绘出三种细菌油镜下的染色视野图。注明物镜放大倍数及总放大倍数。 判定未知菌 [注意事项] 1. 取菌时要严格无菌操作 2. 严格控制染色和脱色时间 3. 细菌涂片要薄，镜检以分散开的细菌的颜色为准，过于密集常常呈假阳性。 操作录像 * * 脱色 用卢戈氏碘液媒染约l?min?，水洗。 媒染 ?用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。 ????革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。 复染 在涂片上滴加番红液复染约3～5min?，水洗，然后用吸水纸吸干。 革兰阳性 革兰阴性 Gram Stain of Staphylococcus aureus Gram Stain of Escherichia coli A Gram Stain of a Mixture of Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria. 枯草芽孢杆菌 乳酸杆菌