I第二章核酸化学解说.ppt

* 1950年 * 1962 年，WilkinsWilkins、WatsonWatson和CrickCrick共获诺贝尔化学奖。 * ● 核酸分离纯化的一般原则： 1.去除蛋白质和其他杂质； 2.保持天然状态。 ●核酸分离纯化的一般步骤： 第一步，破碎细胞。 第二步，去除蛋白质和其他杂质。 第三步，去除其他杂志核酸。 最后得到纯化的核酸。 1. DNA提取的基本步骤： I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 ? V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 一、 核酸分离提取： DNA的分离纯化 CTAB法： 1. 用液氮冻融，然后破碎细胞的同时，用含有CTAB的提取缓冲液使DNA与蛋白质解联。 2. 蛋白酶K消化以使蛋白质裂解。 3. 通过缓冲液饱和的苯酚抽提以除去蛋白，或利用氯仿-异戊醇处理除去蛋白。 4. 加入一定量的NaAC或LiCl, 用70%乙醇沉淀DNA。 5. 利用琼脂糖凝胶电泳进行进一步分离和鉴定。 SDS法：1. CTABSDS 2. 主要靠饱和苯酚抽提。 　CTAB法 CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，可通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 　CTAB提取缓冲液 的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) 0.1%（V/V）使用前加入 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。 基因组DNA－ CTAB法 　CTAB法流程图： 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 （1） 材料准备 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集 基因组DNA的提取 注意事项 （2）细胞裂解 适量。过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理 方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡 基因组DNA的提取 注意事项 （3） 核酸分离、纯化： 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。 基因组DNA的提取 注意事项 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用 多糖水解酶 将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯 (1/2, v/v)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 注意事项 多酚的去除： 在抽提液中加入 防止酚类氧化 的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70％的乙醇洗涤 注意事项 （4） 核酸沉淀、溶解 当沉淀时间有限时，用预冷的 乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。 沉淀时加入1/10体积的