单克隆抗体的制备7要点.pptVIP

概要 第一代抗体：多克隆抗体 第二代抗体：单克隆抗体 第三代抗体：基因工程抗体 第四章　单克隆抗体制备 英文全称： monoclonal antibody,McAb 定义： 每一克隆B细胞所产生的理化性状高度均一、组成均一、只与同一种抗原决定族反应的抗体。 Hybridoma Technology and Production of Monoclonal Antibodies? - Monoclonal antibodies can be produced in specialized cells through a technique now popularly known as hybridoma technology. This technology was discovered in 1975 by two scientists, Georges Kohler of West Germany and Cesal Milstein of Argentina, who jointly with Niels Jerne of Denmark were awarded the 1984 Nobel, Prize for Physiology and Medicine. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 for theories concerning the specificity in development and control of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies 1、阳性杂交瘤细胞的克隆化 2、细胞的冻存及复苏 一)、抗原的提纯与动物免疫 1、抗原： 纯度越高越好。 细胞抗原：10×107个细胞作腹腔免疫。 可溶性抗原：与佐剂配合使用。 2、动物选择： 选择BALB/c健康小鼠，8-12周，雌雄不限；同时免疫3-4只小鼠。 3、免疫方法： 同多克隆抗体。 一)、抗原的提纯与动物免疫 3、免疫方法： 细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原; 3~6周100~200微克抗原; 融合前3天，加强免疫; 末次免疫后，分离脾细胞。 二)、骨髓瘤细胞的制备 各种骨髓瘤细胞株圴可，但应用最多的是Sp2/0细胞株。 选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中 三)、饲养细胞 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化 制备方法：用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞 。 四)、细胞融合及筛选 五)、扩大再生产 六)、抗体的纯化及鉴定 1、纯化： 一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的。 目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法 六)、抗体的纯化及鉴定 2、性质鉴定： 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3) 50% PEG 1min内加完; 2min内加10mlHAT培养液 动物体内诱生方法： 选用BALB/c或F1代小鼠 前5天进行,预先腹腔注射pristane或甘油 （5～10）×105/只腹腔注射细胞 1～3w形成腹水 体外培养法： 中空纤维培养系统 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除 Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示? 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和力测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot * * 请简述多克隆制备过程。 采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。 此类抗体作为诊断试剂有何缺点？ 产量低、特异性差、纯度低，反应不够灵敏。 为克服多抗的缺点，可用什么物质替代？ 单克隆抗体。 B B B B Ag Ag Ag Ag 传统免疫学清制备机制 人体 人体 邓念华 临床微免教研室 表位A 表位B 表位C