SCGE法检测DNA损伤(包括DNA单链断裂和DNA交联).docVIP

SCGE法检测DNA损伤 SCGE的原理SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。 若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。 0.4 M Tris-HCl（PH=7.5）； 无水乙醇；20-30μg/mL 溴化乙锭（EB）。 2. 方法 1.在体外实验中,将对数期生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞备用。在体内实验中,取需测试的脏器或组织,用磷酸缓冲液( PBS,PH 7.4) 洗净后,剪至糜状滴加PBS(PH 7.4) 研磨,过300 目筛子,收集细胞,悬浮于PBS(PH 7.4) 中, 细胞密度为（1-5） x 104-6个/ mL （血细胞计数板最中央每小格0.5个细胞）,台盼蓝染色、镜检、细胞存活率90 %以上,即可进行以下操作。 2.样品处理： 1）通过尾动脉取血，肝素或枸椽酸钠抗凝，800r/min离心5min，加等体积无钙镁磷酸缓冲液，获得细胞悬液。 a.枸椽酸钠抗凝:有2Na3C6H5O7。和2Na3C6H5·11H2O等多种晶体。通常用前者配成109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用。 b.肝素（heparin）每毫升血液抗凝需要持素15±2.5Iu. c.EDTA盐经1000C烘干，，15g/L水溶液，0.4ml，5ml血液。EDTA盐对红、白细胞形态影响很小. 2）过氧化氢处理：细胞悬液分成两份:A份1ml； B份0.9ml。 B份里再加0.1ml 5mmol的过氧化氢，混匀。全部冰浴1小时。完后检测细胞存活率(台盼蓝染色、镜检)(过氧化氢处理用于检测DNA交联)。 3）应用细胞悬液制备：4度下，1000r/min离心5分钟。去上清，加PBS(PH 7.4)。每份制作2片凝胶。 3. 制胶 将载玻片用砂纸(粒度No. 380)磨出痕迹, 以便凝胶附着. 将37C正常溶点0.6％琼脂糖液（溶于不含Ca2+、Mg2+的PBS，需要沸水加热）75-100μl铺展到预热的磨痕载玻片上，作为第一层凝胶，盖上盖玻片4℃凝固10分钟以上, 去掉盖玻片后加入制备的细胞悬液85μl(10μl含1000 个细胞的PBS和75μl 0.6%的低熔点琼脂糖(LMA) 在37℃混匀)铺展到载玻片上作为第二层, 4℃至少10分钟, 凝固后再铺展低溶点0.6％琼脂糖100μl作为第三层, 使载玻片上琼脂糖呈“三夹层”式. （注意：NMA 适宜浓度0. 5 %～1 % ,,铺胶前载玻片预热,有利于铺植平整。LMA 凝胶浓度直接关系到DNA 迁移长度 ,0. 6 % 较适宜。第3 层LMA 可不铺。微量加样器吸头前端残留凝胶勿吹出,以防形成气泡。移去盖玻片时注意勿损伤胶膜） 4. 裂解 4℃凝固后去掉盖玻片，将载玻片浸人新配制的4℃预冷细胞裂解液（含2.5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM Tris-HCl(PH=10)，用前加1％ TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO）），裂解不少于1h。此步骤的目的即是溶解细胞膜及核膜,除去蛋白质、RNA 等,仅存留核骨架。 5. 电泳 裂解后将玻片晾干，并列置于水平电泳槽的阳极端，电泳缓冲液(0.3M NaOH、1mM EDTA)盖过胶面约2.5mm，静置20-60min解链。之后接通电源，电泳条件25V，300mA，时间20-40分钟。通过调节液面来调电压。(电压先调到最大，电流300mA然后通过液面来调节电压)。 （注意：电泳时电压、电流及时间的长短会直接影响DN