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转基因烟草GUS组织化学染色（1） LAT52 CK- 4-5 1-4 萌发花粉的GUS 组织化学染色（2） LAT52-2 CK- 4-9 GUS基因GU GUS基因组织化学染色（3） 35S-7茎横切 2-2茎横切 转基因烟草GUS酶活性检测 LAT PB1 PB2 PB3 PB4 PB5 PB6 PB7 19Z 35S CK- 表达载体构建 DNA分子的体外连接（DNA连接酶） 粘性末端连接 连接效率高 相同酶切末端 平端连接 连接效率低 1. 限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息 GAATTC CTTAAG EcoR I G CTTAA 5’p 5’p CTGCAG GACGTC Pst I CTGCA G 5’p 5’p 3’OH 3’OH 3’OH 3’OH 注意：不同公司的酶，其缓冲液有时是不同的； 同一公司的酶，使用相同的缓冲液或不同的缓冲液而不显著影响酶活性时，可同时做双酶切。 一种酶可能有几种缓冲液。 CCCGGG GGGCCC Sma I 怎样使用公司目录： 酶的质量标准 酶单位：用的酶量，时间，温度（一般为37oC,但许多霉对温度有特殊要求), DNA量，切后再连接的程度，有无其他活性等 ； 酶的浓度：10 units/ul; 20 uints/ul等 切割位点： 所用底物： 反应温度： 对甲基化的要求： 附录： 不同酶的反应缓冲液及活性 双酶切 酶切后具有共同的粘性末端： 5’-GATC: BamHI, MboI, Bgl II 5’CTAG: SpeI, Xba I, NheＩ 5’TCGA: Sal I, Xho I MxNas1表达载体的构建 Xba I Sac I双酶切 T4连接酶 正义表达载体 XbaI和SacI双酶切 T4连接酶 反义表达载体 表达载体的酶切及PCR鉴定 1、2分别为正义和反义表达载体的Xbal I 和Sac I双酶切鉴定 3、4分别为正义和反义表达载体的PCR鉴定 谢谢！ * 植物基因工程常用的报告基因 指其编码产物能够被快速地测定、常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 作为报告基因的条件 在转化的寄主细胞中应不存在相应的内源等位基因的活性， 其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且还应具有快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。 报告基因 1、绿色荧光蛋白基因 （GFP green fluorescence protein ） 2、B-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因b-D-glucuronidase ） 3、荧光素酶基因（LUC fire fly luciferase ） 4、氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因） 5、抗生素基因 Jellyfish Aequorea victoria: one of the oldest species on the earth Green Fluorescent Protein (GFP) ???????????????????????????????????????????????????????????????????????? This is a stereo view of GFP generated from the Brookhaven Database using R If you have the Chyou may follow the links to see GFP in action! Last updated (c) 1997 RWZELLER GUS酶的底物是无色的X-葡萄糖苷酸（X-glucuronide, X-gluc) GUS酶的显色反应以底物不同而不同： 5-bromo-4-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 靛蓝 5-bromo-6-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 橘红 4-methylumbelliferyl-B-D-glucuronide 荧光产物 B-glucuronidase(GUS) 检测方法 用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性 组织化学染色定位法 该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质。 初始产物并不带有颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化