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《生物饵料培养学》实验讲义 王珺 冯永勤 海南大学海洋学院 2010年6月 目录 实验一 单细胞藻浓度的测定 ………………………………………1 实验二 单细胞藻培养的容器、工具及用水的消毒 ………………3 实验三 单细胞藻培养液--母液的配制 ……………………………5 实验四 单细胞藻一级培养 …………………………………………7 实验五 轮虫的分离与培养 …………………………………………9 实验一 单细胞藻类浓度的测定 【实验目的】 掌握用血球计数板计数单细胞藻类的方法。 掌握使用分光光度计进行单细胞藻类计数的原理、方法。 【实验原理】 1. 制作工作曲线。取一定量的单胞藻液，稀释成5个梯度，分别用分光光度计测定其吸光度（O.D.），并用血球计数板测定相应藻液的藻细胞个体浓度，由于藻细胞浓度与吸光值的大小成正比关系，根据各组数据绘出吸光度-藻细胞浓度的相关曲线，即工作曲线。 1.1 血球计数板计数的原理 血球计数板是一块比普通载玻片厚的载玻片特制而成的，板的中部有一“H”形的凹沟，在凹沟包围的上、下两块地方比凹沟外的两条高起的边低0.1mm，在此部的中央划线为一具有准确面积的大小方格，在其中分为九个方格，每一大方格的面积是1mm2，在四角的大格又分为16个中格，在中央的大格分为25个中格，每一中格分为16个小格，共400个小格；另外一种计数板的中央大格分为16个中格，每一中格分为25个小格，总数400个小格，加盖玻片后，每一大格即形成一个体积为0.1mm3的空间。 2．测定被测藻液的吸光度。 3．根据工作曲线查出藻液相应吸光度的藻细胞浓度。nm；金藻门藻类、硅藻门藻类一般选择的波长为420nm）。 1.2 用血球计数板分别计数工作曲线用的藻细胞浓度。 1.2.1 把血球计数板及盖玻片擦洗清洁、平放在桌上、并盖好盖玻片。 1.2.2摇匀工作曲线用的藻液，用一支干净的平口微吸管吸取藻液，迅速把吸管放在计数板旁的盖玻片边缘处，轻压橡皮头，使藻液流入计数板内（如果样品是有运动能力的种类，则应加入碘液杀死，才能取样计数）。 1.2.3 稍停一分钟后，在低倍镜下（细胞太小需用40×10倍）计数中央大格（400个小格）和东北、西北、西南、东南等4个大格（16个中格），每个样品重复计数两次，然后取其平均值。得： 1ml水体的藻类细胞数目=计数平均值×稀释倍数×10000个（简记：万个/ml） 2．测定被测藻液的吸光度。 3．根据工作曲线求出藻液相应吸光度的藻细胞浓度（或由公式：被测藻液的藻细胞浓度=工作曲线中总的藻细胞浓度/工作曲线中总的吸光度×被测藻液的藻细胞吸光度）。 【注意事项】 1.血球计数板计数时，藻液不能溢出盖玻片上方，若有溢出，需冲洗干净，重新取样，注意控制藻液流入量，不能过多，也不能过少，应充满计数板的部分，不能有气泡。 2.应注意摇匀后，再取样进行测定或计数。 3.如果藻细胞浓度太大，应稀释后才计数，计数结果应乘以稀释倍数。 4.运动的藻类，应杀死后才能计数。（建议：稀释液中含有固定液） 【作业与思考】 1.绘制工作曲线。 2.计算出你测定的单细胞藻的细胞密度。 3.你是如何减少计数所造成的误差？ 实验二 单细胞藻培养的容器、工具与用水的消毒 【实验目的】 学习并掌握培养单细胞藻的容器工具及用水的消毒方法，为今后成功培养单细胞藻打基础。 【实验原理和基础知识】 单细胞藻培养用的工具、容器及水都必须经过严格消毒，尽可能杀死一切生物，以免污染影响藻类生长和繁殖。 【实验用品】 一、实验器材 仪器设备：恒温干燥箱、电炉、电子天平、充气泵。 工具容器： 250ml三角烧瓶（每人2只） 400ml烧杯30只 3000ml三角烧瓶10只 (6人/组) 搅拌棒 20根 移液管（5或10ml） 30支 塑料桶 4个 移液管（1ml） 30支 乳胶管 若干 容量瓶（100ml） 30只 量筒100ml 30只 二、药品 浓硫酸、重铬酸钾、漂白水或次氯酸钠溶液、硫代硫酸钠。 洗液的配制方法：称15g重铬酸钾至干燥的烧杯中，然后加入200ml粗硫酸，搅拌并加热至重铬酸钾溶解，即得洗液，冷却后将上清液倒入试剂瓶中备用。 三、实验材料 海水200L、淀粉碘化钾试纸2包、充气管、充气石10粒。 【实验操作步骤】 一、工具、容器消毒方法 1．洗液消毒法 所有待用三角瓶、烧杯、容量瓶等玻璃器皿均先用自来水（加去污粉）冲刷干净，然后倒入少许洗液，沿着内壁慢慢转动器皿，使其全部浸泡，放置10min后，将底部洗液回收（以备后用），然后用自来水冲净瓶子，把瓶口朝下晾干。移液管应用