分子生物学研究的主要方法10版资料.pptVIP

这 是 真 的 吗？ 分子生物学研究主要方法Molecular and cloning technology 聚合酶链反应PCR DNA电泳 基因转移 核酸杂交 聚合酶链反应PCR Kary B Mullis Michael Smith PCR 用检测目标基因 A 以一股DNA单链为模板，在引物（primer）的存在下，DNA多聚酶沿模板以5′→3方向延伸引物的过程。 （1〉变性：加热使靶DNA欢链解离成两条单链。 （2）引物与靶DNA退火：降低温度至遥当水平，促使两个引物根据碱基互补的原理分别结合至靶DNA两条链的3‘末端。 （3）引物延伸：在DNA合酶催化下，引物沿着靶3‘末端向5’末端延伸 经25～30次循环后，实际值一般为105～107。 2．水生嗜热菌，称Toq DNA多聚酶，如下特点： 1）热稳定性：95℃。 2）高特异性：最适温度为70～75℃，因此，允许引物与模板在55～60℃退火，在72℃延伸。 3）适宜较长DNA片段的扩增 （1）引物：引物一般通过化学合成获得，长度为15～30碱基为宜； （2）底物浓度：四种脱氧三磷单核苷酸dCTP、dATP、dGTP和dTTP的总称。dATP、dCTP、dGTP和dTTP浓度应相同。 （3）温度：变性温度，一般为94℃左右，20～30秒；复性温度，一般为55～60℃，30秒；延伸温度，一般为72℃左右。 （4）循环次数：25～30个循环。 Video PCR More Cycles = More DNA DNA 分离 测序 探针 克隆 提纯 琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，当琼脂糖加热至90℃左右，即可形成清亮、透明的液体。 浇在模板上冷却后固化形成凝胶。其凝固点为40～45℃。通过琼脂糖凝胶电泳可识别分子量相差100碱基对（bp）的DNA片段。 DNA琼脂糖凝胶电泳 DNA电泳 可分离不同分子量的DNA DNA琼脂糖凝胶电泳 各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中向相反电极移动。 利用这一原理可以通过电泳将不同分子量的DNA分离，通过荧光染料染色鉴定各DNA片段的分子量； 从凝胶中回收DNA片段，用于各种克隆操作。 分 离和 提 纯 DNA 分离 测序 探针 克隆 提纯 （二）DNA连接酶 催化DNA中相邻的3‘-羟基和5‘-磷酸基团之间形成 3 ’，5 ’ -磷酸二酯键而将断开的DNA连接起来。 T4 DNA连接酶和大肠杆菌连接酶。 限制性内切酶 Ⅱ型限制性内切酶具有以下几个特征： ①有特定的识别序列，通常为4～6个碱基对； ②切割点位于识别序列内的固定位置上。其5‘端有磷酸基因，3’端有羟基基因； ③酶切后形成粘性末端或平齐末端。 有100余种已在市场上销售。 限制性内切酶酶解反应 与其他酶促反应一样，限制性内切酶酶解反应需要一定的反应条件 . 主要包括：①缓冲系统，不同的酶往往要求不同的缓冲系统。目前有很多生物技术公司均生产多种缓冲液，一般配成10倍贮存液，使用时按1／10反应体积的量加入。 ②反应温度，大多数限制性内切酶的反应温度为37℃。但亦有酶促反应最适温度高于或低于37℃的酶。 ③反应体积，一般在不少于10ul或20ul。 （三）质粒 质粒（plasmid）是一种细菌细胞内独立于染色体外的环状DNA，它具有自我复制能力。在细胞分裂时可伴随染色体分配至子细胞中去。 由以下几部分构成： ①Ori 区，质粒复制的起点； ②par区，保证在细胞分裂过程中，质粒被均等地分配至子细胞； ③多克隆区，人为构建，该区含多个单一限制性内切酶酶切”点，便于在此区将质粒切开而加人外源DNA ④选择因子，常含耐抗生素基因 在分子克隆中，质粒常被用作外源DNA载体，将外源DNA片段插入质粒后再将该重组质粒转化大肠杆菌。 该质检能在大肠杆菌中大量繁殖，所携带基因也随之扩增。此时再从大肠杆菌中提取质粒，切割、分离出外源插人DNA片段，进行基因分析。 Video Recombinant DNA （五）转化、转染、转导 转化（transformation）是指受体菌捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程； 转染（transfection）是专指受体菌捕获和表达噬菌体DNA分子的过程。 转导是利用噬菌体颗粒为媒介，将外源DNA转移至受体菌并得到表达的生命过程。 从本质上讲，两者间没有根本差别。 细菌种属与细胞壁结构的差异，转化条件与过程均不一样。受体细胞并非随时均可捕获外源DNA，只有在一定条件下，受体细胞达到感受态（competence）时，方能获取并表达外源