研究生PCR介绍.pptVIP

PCR克隆DNA调节序列以及缺失体的构建 应用：基因转录调控研究 注意事项： 许多基因启动子富含G+C，需设计较高Tm值的引物。PCR反应条件是两步：94度变性，68度退火和延伸。如果仍不能扩增出产物，可考虑加入DMSO或甘油等佐剂； 选用高保真的DNA聚合酶； 下游引物必须在转录起始点下游； 常利用PCR构建5’端缺失体，寻找调节基因的关键元件。 常规定量PCR技术： —对PCR扩增反应的终产物进行定量 —重复性差 —半定量 实时定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量 实时荧光定量PCR real-time PCR Real-time PCR 概念 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 1. Real-time PCR 定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 （1）扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle） 纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 （2）荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过阈值 （3）Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 （4）Ct值与起始模板的关系 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。 在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为M。 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值，就可计算出样品中所含的模板量。 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 25 2. Real-time PCR 荧光标记方法 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor Q Q R 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相） 2-ΔΔC(t) 双标准曲线法 3. Real-time PCR 的定量方法 相对定量中的内标 内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 绝对定量的标准样品 已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA 用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）