重组DNA技术的应用说课.ppt

引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 Primer design 2 引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 Primer Premier 5.0 搜寻到引物结果最终 显示在下面的窗口中： 并按优劣次序（Rating） 排列，满分为100 Conjunction of fragment and vector 3 重组逆转录病毒载体由于缺乏结构基 因，不能包装完整的有感染能力的病毒 颗粒。因此，需要将其导入整合有辅助 病毒的包装细胞，才能完成生活周期。 * 重组DNA技术的应用 Mus musculusOCT4 (Pou5f1) geneCloning and Expressing The literature query Paper books and journals Biological website 小木虫： http:// 生物通： 生物谷： 丁香园： 3. Database Process Gene sequence 1 Primer design 2 Transform and screening 4 expression 5 Conjunction of fragment and vector 3 How to gain the information of OCT4 1 (1) NCBI 可知在编码序 列中有内含子. Coding sequence的缩写，是编码一段蛋白产物的序列，是结构基因组学术语 产物 CDS join(62…445, 3065…3185, 3370…3500, 3943…4101, 4250…4513) CDS join(62…445, 3065…3185, 3370…3500, 3943…4101, 4250…4513) 由352个氨基酸编码 (2) UCSC *