专题 课题多聚酶链式反应扩增DNA片段说课.pptVIP

* 1、概念：PCR全称为_______________，是一项在生物______复制_______________的核酸合成技术 2、原理：______________________ 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 依据细胞内DNA复制条件 多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段 5、结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。 4、方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数） 指数 2n 3、条件： _________、_______________、________、 ______、__________________________、 ____________________________________。 DNA模板 四种脱氧核苷酸 一对引物 耐热DNA聚合酶（Taq酶） ATP 缓冲液（相当于细胞液）、适宜的T、PH 细胞外DNA复制的环境 在DNA复制中的作用 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 引物 催化合成DNA子链 耐热DNA聚合酶（Taq酶) 合成子链的原料 4种脱氧核苷酸 提供DNA复制的模板 DNA母链 打开DNA双链 解旋酶 参与的组分 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 多脱氧核苷酸链结构简图 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5’ 3’ 3’ 5’ 1’ 2’ 4’ 1’ 2’ 4’ 磷酸二脂键 磷酸二脂键 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。 多脱氧核苷酸链得形成 PCR原理 ①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 ③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 ①DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。 ②DNA聚合酶作用 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 ③耐热DNA聚合酶（Taq酶）应用 由美国微生物学家于1966年在美国黄石国家公园的一个热泉（水温约为70—800C）中，从水生耐热细菌Taq中提取的。 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。 ④ 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 6、 PCR的反应过程 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤：变性、复性和延伸。 ① DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________。 氢键 单链DNA ② 复性（退火：55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_______。 ③ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。 双链 DNA链 脱氧核苷酸结构式 利用PCR技术扩增目的基因的过程 *