毕赤酵母表达实验手册详解.docVIP

毕 赤 酵 母 表 达 实 验 手 册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许 多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等 过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。 另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋 白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化， 但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过 程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品 大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核 生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有 活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外 源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快， 易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加 工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统 缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制 和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（ Saccharomyces.Cerevisiae ）在分子遗传学方面 被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981 年酿酒酵母表达了第一 个外源基因干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。 干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实 验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中 维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效 表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培 养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克 服酿酒酵母的局限，1983 年美国 Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（ methylotrophic yeast ）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida 等．以 Pichia.pastoris （毕赤巴斯德酵母） 为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应 用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； 具有醇氧化酶 AOX 基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且 减少对细胞的毒害作用。 Pichia.pastoris 基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系 统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖 基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子 AOX 1 ，已高效表达了 HBsAg、TNF、EGF、 破伤风毒素 C 片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实 用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常 适宜扩大为工业规模［14］。目前美国 FDA 已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自 该系统的 Cephelon 制剂已获得 FDA 批准，所以该系统被认为是安全的． Pichia.pastoris 表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表 达，提供更为广泛的基因工程产品［9、11］。 近年来，Invitrogon 公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有 300 多 种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。 毕赤酵母宿主菌常用的有 GS115 和 KM71 两种，都具有 HIS4 营养缺陷标记。其中，GS115 茵株具有 AOX 1 基因，是 Mut ＋ ，即甲醇利用正常型；而 KM71 菌株的 AOX1 位点彼 ARG4 基因插 入，表型为 Mut s ，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。 Pichi