chapter++细胞破碎说课.ppt

* 包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。 包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。 高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？ 蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀； ②蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀； ③蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀； ④表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态 ⑤ 蛋白质自身不稳定。 包含体的构成 * 基因工程包涵体的纯化方法 收集菌体细胞 细胞破碎 包涵体的洗涤 目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性 包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。 欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。 * 1）包涵体的洗涤 细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度:以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。 * 2）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂： ▲ 5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用； ▲ 表面活性剂如1-2％ SDS， 作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 ▲ pH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。 影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。 * 原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。 复性方法： 稀释法除变性剂 － 加入大量水或缓冲液。 膜分离法除变性剂 － 透析、超滤、电渗析。 层析法：凝胶层析，高效疏水层析 3） 目标蛋白的复性 * 蛋白质复性影响因素： 变性剂浓度 目标蛋白浓度； pH和离子强度； 氧化还原条件。 还原剂： 二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽； 氧化剂： 氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。 复性区 多聚物生成区 絮凝沉淀区 盐酸胍浓度mol/L 红血球碳酐酶复性操作中变性剂 与蛋白质浓度对复性的影响 蛋白质浓度 mol/L * 包涵体获得几种常见的工艺路线(一) 机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨） 离心提取包含体 加变性剂溶解 除变性剂复性 * 特点:是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。 优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。 路线1 的特点 * 包涵体获得几种常见的工艺路线（二） 机械破碎 膜分离获得包涵体 加变性剂溶解包含体 除变性剂复性 * 路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。 优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。 缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。 路线2 的特点 * 包涵体获得几种常见的工艺路线（三） 化学破碎 （加变性剂） 离心除细胞碎片 除变性剂复性 * 用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。 路线三： * 包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取） * 来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离