PCR扩增检测乙肝病毒说课.pptVIP

实验三：PCR扩增检测乙肝病毒 乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我国发病率很高 ，HBV的检测极其重要。 HBV DNA存在就可以引起乙肝的传染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复制的发动机 。 PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察及预防研究工作最理想的方法之一。 一、实验目的 1.掌握PCR技术扩增的原理 2.熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作过程。 二、实验原理 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction) 简称PCR,是在体外条件下利用DNA聚合酶、催化一对引物间的特异性DNA片段合成的基因体外扩增技术，它包括三个基本过程： 三、主要器材及试剂 1.主要器材： 2.主要试剂： 四、操作步骤 1.标本处理：取患者血清40μl，加入DNA提取液40μl，沸水浴10分钟，10000转离心5分钟，取上清液4μl做PCR反应。 2.加样： 加入提取好的标本4μl，6000转离心10秒。 三个扩增步骤温度及时间 4.电泳检测： ①制备2%琼脂糖凝胶 `` ②加样：取扩增后的产物10 ul点样于凝胶孔 ③电泳：点样端接“-”，稳压，50V，电泳30分钟。 五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色条带则为HBV阳性 五、注意事项 1. 试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充分融化离心。 2. 反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从反应管底部吸液。 3. EB为强致癌物，操作过程应注意防护。 4. 注意无菌操作，以免出现假阳性。 HBV阳性 HBV阴性 HBV阳性对照 HBV阴性对照 正极 负极 点样孔 *Allison Anne Welder, Ph.D. * * * * * * * * * * * 1.变性：加热使双链DNA变为单链 2.退火：急速降温使引物和互补模板 在局部形成杂交链 3.延伸：耐热DNA聚合酶按5 ′→3′ 方向催化以引物为起始点的 延伸反应 模板DNA 高温变性 低温退火 引物 适温延伸 经过25-35次循环后，目的片段扩增2n倍 两条子代DNA 一 次 循 环 Tap酶 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 9700型PCR仪 电泳槽、电泳仪 紫外分析仪 台式高速离心机 HBV-PCR定性检测试剂盒 PCR反应管 HBV阳性标本 DNA提取液 取试剂盒中PCR反应管 TapDNA聚合酶 10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引 物(小分子DNA片段） Mg2+ 变性 93℃ 45″（首次5′） 退火 55 ℃ 45″ 延伸 72 ℃ 60″（末次5′） 温度 时间 循环次数：25次 3.PCR仪上扩增： PCR仪上扩增 加入标本 离心 6000转离心10秒 2%琼脂糖的制备： 电泳槽的准备： 称取 0.8g琼 脂糖 40mlTBE 电泳缓冲液 （PH8.0) 煮沸溶解 加入 冷却 60℃左右 加入 溴乙啶 EB20μl 倒胶 取样 点样 * * * * * * * * * * * * * * * ? 2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd. ? 2004 McGraw-Hill Ryerson. * * * ? 2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd. ? 2004 McGraw-Hill Ryerson. * * * * ? 2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd. ? 2004 McGraw-Hill Ryerson. * * * * * * * * * * * * ? 2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd. ? 2004 McGraw-Hill Ryerson. * * * ? 2004 McGraw-Hill Ryerson Ltd. ? 2004 McGraw-Hill Ryerson. * * * * ? 2004 McGraw-Hill