北京化工二厂原址附近地区土壤微生物群落结构研究详解.docVIP

北京化工二厂附近地区土壤微生物群落结构研究 1北京市广渠门中学 2北京师范大学附属实验中学 指导教师：耿 爽1 刚永运2薛慧君3闻 红4 1北京大学微生物生态与生物技术实验室 2北京师范大学附属实验中学 3北京师范大学附属实验中学 4北京市广渠门中学 摘要：随着经济的快速增长，环境污染问题得到了越来越多的关注。在治理城市污染过程中，不少重污染的企业完成了搬迁工作。然而，企业原址仍然存在未妥善处理的污染源，为土壤修复带来了阻碍。土壤微生物是土壤生态系统的重要组份之一，对土壤微生物群落结构的研究将有利于了解土壤生态系统的功能及稳定性，对评价土壤健康具有重要指示作用。因此，本研究选择了北京化工二厂原址附近土壤9个采样点，27个样品进行分析，完成理化性质测定及微生物细菌群落末端限制性片段长度多态性分析。结果显示27个样品中微生物群落结构与含水量、pH相关性不强，但群落结构与采样点位置有较强相关性。距离污染水源较近及较远的采样点样品，其群落结构分别形成较为明显的聚类。该结果说明未妥善处理的污染水源对附近土壤微生物群落结构产生了影响，可能不利于该地区土壤的修复。 ：土壤微生物群落结构-RFLP 引言 北京化工二厂，曾于1980年锅炉发生设备事故，造成重油泄露，并引起大火；曾于2005年发生爆炸引起大火。两次重大事故的污染，对周边地区生活环境的影响很大；不仅如此其近五十年来生产过程中排放的污水，其中包括汞等重金属以及各种气体有机物对环境的危害不能小视。尽管北京化工二厂已经迁走，废水及废气的排放得到了有效遏制，但附近的污染水源、进入土壤的废渣并未完全清除，只能借助环境的自我净化功能。土壤的自我净化， 对于土壤来说，土壤微生物是土壤生态系统的重要组份之一，几乎所有的土壤过程都直接或间接地与土壤微生物有关，如分解土壤有机质和促进腐殖质形成，与植物共生促进植物生长，在有机物污染和重金属污染治理中起重要作用等1]。土壤微生物是指示土壤生态系统稳定性及其功能的重要传感器，对土壤健康具有重要的指示作用。近年来将土壤微生物群落结构组成、土壤微生物生物量、土壤酶活性等作为土壤健康的生物指标来评价退化生态系统的恢复进程和指导生态系统管理等已逐渐成为研究热点2]。因此，对土壤微生物群落结构多样性进行研究，将有助于我们全面、系统地综合评价土壤受污染的状况。 研究土壤微生物多样性的方法大致可分为两类一类是基于培养和分离手段来揭示土壤微生物群落变化另一类是基于生物指示分子如DNARNA及磷脂脂肪酸变异模式的土壤微生物多样性2]。第一类方法属于传统方法，通过分离培养、测定生理生化、细胞化学成分分析来进行对微生物群体的多样性以及群落结构的研究[3]。用培养的方法虽然可以代表可培养部分微生物的多样性，但是很难分离到环境样品中所有的微生物，另一方面被分离培养的微生物通常并不是自然环境中的优势种群。显然，以传统方法得到的多样性结果无法反映系统中微生物群落的真实组成。相较之下，第二类方法表现出诸多优势。20世纪80年代中期，美国科学家Norman Pace首先绕开了对环境微生物的培养，直接利用环境样品的总DNA进行了16S rRNA基因的PCR扩增并进行鉴定。16s rRNA基因是原核核糖体30S小亚基的组成部分相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，并对微生物种类的鉴定提供了重要依据。从这以后的20多年里，分子生物学技术的广泛应用克服了传统方法的限制，使得微生物学者可以从群体水平上直接分析群落组成，分析个体与群落的关系。分子生物学技术的应用极大推动了微生物生态学的发展，极大地丰富了微生物生态学研究的方法，从而导致了微生物分子生态学的产生。微生物分子生态学技术使我们可以不依赖于微生物的分离培养技术，而在基因组DNA水平上对复杂的微生物系统进行分析。借助分子标记、核酸指纹图谱等分子手段我们可以研究生物进化、遗传和物种多样性、生物对环境变化的相应对策、转基因生物的环境释放等问题[4]。 末端限制性片段长度多态性技术[5]（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，简称T-RFLP）是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法，正受到研究人员的重视和青睐。该技术已经成功应用于各种微生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及结构特征等多方面。T-RFLP是建立在16S rRNA基因分析基础上的技术。细菌的16S rRNA存在保守区和可变区，根据这些保守区可以设计出细菌的16S rRNA通用引物，用它们可以扩增出所有细菌的16S rRNA片段，而16S rRNA可变区的差异则可以用来区分不同种的细菌。在设计保守区的引物时，其中一个引物的5’端用荧光物质标记，常用的荧光物质有HEX、TET、6-FAM等，然后提取待分析样品的总