不同类型细胞的培养特点详解.ppt

第六章 个别细胞和组织的培养  类型： 正常细胞培养 肿瘤细胞培养 第一节 正常细胞培养 正常细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难。 正常细胞难培养的原因是它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格. 但只要一切条件适当仍有培养成功可能。 一、上皮细胞类培养 上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层； 培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。 (二) 胃上皮细胞培养 适于胃上皮细胞生长的条件是： ①胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞； ②应用胶原底物培养； ③制备含有特定成分的培养基； (三) 肝细胞培养 肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获得典型上皮细胞培养。 1．初代组织块培养： 肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝剪成1mm3 左右的小块，采用贴壁培养法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日即可出现生长晕。 (四) 内皮细胞培养 应用材料： 人脐带脐静脉、动物大动脉等， 用灌流消化法获取细胞最为简便。 (五) 毛细血管内皮细胞培养 毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。 近年毛细血管培养已获成功； 利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌组织(如卵巢癌) 等均可； 二、结缔组织类细胞培养 (一) 成纤维细胞培养 包括人在内的各种成纤维细胞都很容易培养，也是其它组织培养时的副产物，极易获得。 用人或动物胚体为好；动物可用小鼠或鸡胚，去头和内脏，剪成小碎块后，用胰蛋白酶消化法培养；如为人胚，可取皮肤培养。幼儿包皮是培养成纤维细胞的很好对象。 小鼠成纤维细胞培养条件 12.5~14.5d胎龄的小鼠胎儿分离效果最好； 最佳培养基为DMEM添加15%小牛血清； 第3代细胞增殖最旺盛； 室温条件下，0.125%胰蛋白酶消化时间以8~10min为宜。 在培养ES细胞时，应选择第3~5代的小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞。 三、肌组织细胞培养 以心肌和骨骼肌培养较为实用。 (一) 骨骼肌细胞培养 动物胚或幼体的大腿肌组织为最好的培养材料。取材常用生后1 ~ 2 天的乳鼠(Wistar 大鼠更好)。 (1) 取材：杀死动物，无菌取大腿肌组织，切成0.3 ~ 0.5 厘米小块； (2)消化：用不含钙镁离子的Hanks 液配的0.25％胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过，合成培养基加10％小牛(或马)血清培养，为促进分化可加1％ 的胎汁； (二) 心肌细胞培养 最常用材料： 鸡胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎儿心肌等都可应用。 心肌是比较容易培养和生长的组织，可应用多种方法进行培养，如悬滴培养、组织块培养和消化培养法等，主要取心室肌培养，均能获得良好的生长效果。 第二节 肿瘤细胞培养 肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞，当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。 成纤维细胞排除法 1．机械刮除法： 是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)，或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为： (1) 标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位； (2) 刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间； (3) 用Hanks 液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞； (5) 注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。 小鼠成纤维细胞；细胞来源：swiss小鼠胚胎 (二) 巨噬细胞培养 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。 巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活2 ~ 3周，因之多用作初代培养。 巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如P388D-1、J774A．1、RAW309、Cr. 1 等。 1．培养技术要点： [来源和取材] 巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。 实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，其中以从动物腹腔取材最常用。用40μg 的PHA 注入腹腔中，能产生6 ~ 8×106 个细胞，而且无刺激性，效果较好。 2．培养方法： 培养巨噬细胞可用各种方法和各种来源获取细胞，其中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材料除来源不同外，培养方法大同小异。 [程序] (1) 实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫基乙酸肉汤1ml (勿注入肠内)； (2) 引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3 ~ 5 秒； (3) 置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕