现代基因工程_03DNA纯化后的利用介绍.ppt

寡核苷酸接头分子是人工合成的，其平末端和天然DNA相同，但黏末端不同于天然DNA。 黏末端的3’-OH和通常相同，但5’-P末端经过修饰，它缺少了磷酸基团，形成5’-OH。 这使得DNA连接酶不能够在5’-OH末端和3’-OH末端形成磷酸二酯键。 结果：尽管碱基配对通常发生在寡核苷酸接头分子的黏末端之间，却不能够通过连接形成稳定的联系。 因此，寡核苷酸接头能够被连接到DNA分子上，而不是自身形成二聚体。 在接合体被连接上以后，非正常的5’-OH末端在经过多核苷酸磷酸激酶的处理后，被重新转化成正常的5’-P末端，产生一个能够被插入合适载体的黏末端片段。 第三种-通过附加同聚物反应产生黏末端 同(多)聚物是一个很简单的聚合物，其所有的亚单位都是相同的分子。 一条完全由相同核苷酸，如dGTP，构成的DNA链就是一个典型的多聚物，被称作poly(dG)。 附加多聚核苷酸的反应需要使用末端脱氧核糖核酸转移酶，将一系列核苷酸加到双链DNA分子的3’-OH末端。 如果这一反应是在仅有一种脱氧核糖核苷酸存在的情况下进行的，那么产生的尾巴是多聚物。 为了让两个加上尾部的分子连接在一起，多聚物必须互补。 常用：poly(dC)连接到载体上, poly(dG)连接到将要被克隆的基因上。 当DNA分子被混合时，这两个尾部发生碱基配对。 实际上，poly(dG)和poly(dC)尾部的长度通常不是完全相同，得到的碱基配对的重组分子既有断裂也有缺口。 因此需要两个步骤的修复： 用Klenow聚合酶来填满缺口， 再用DNA连接酶生成最后的磷酸二酯键。 在试管中，这一修复反应并不总是必须要进行。 如果互补附加同聚物反应的长度超过20个核苷酸，形成的碱基配对就已经非常稳定了。 一个以碱基配对而不是完全连接形成的重组DNA分子，通常已经足够稳定，能够在接下来的克隆实验阶段被引入宿主细胞。 一旦进入宿主细胞，细胞自身的DNA聚合酶和DNA连接酶会自动修复重组分子。 通常，DNA分子通过结合携带放射性32P的方法进行标记。 标记方法：缺口平移法和末端填平法。 缺口平移法： 虽然样品的制备过程很小心，但是绝大多数纯化的DNA样品都包含一些带缺口的分子，DNA聚合酶I能够结合到DNA上，并催化替代一条链的反应。 这一反应需要提供核苷酸，如果这些核苷酸中有一个被标记，则最终形成的新DNA本身也被标记上放射性同位素。 缺口平移能够用来标记任何DNA分子，但在某些条件下也能够切割DNA。 末端填平法： 相对温和的方法，几乎不会导致DNA的断裂； 但只能标记含有黏末端的DNA分子。 使用Klenow片段，通过合成互补链“填平”黏末端。 缺口平移和末端填平法都能够标记非常微量的DNA，在凝胶中这样的微量标记能够被放射自显影所检测。在理想条件下每条带小到2ng的DNA都能够被观察到。 3.2.7 DNA分子大小的估计 如何确定凝胶电泳中片段的大小? 最准确的方法：利用迁移速度和分子重量间的数学关系。相关公式是： D=a-b (logM) D是迁移的距离，M是相对分子质量，a和b是依赖于电泳条件的常数。 通常使用：一种简单，但相对不太精确的估计DNA片段大小的方法。 方法：利用已知大小的DNA片段作标准(marker /ladder),目的DNA片段与之比对、估计。 例如：HindⅢ将λDNA切成8个片段，这些片段的大小都已经知道，范围从125bp到23kb。实验中的片段大小可以通过对比两条泳道中条带的位置而加以估计。 尽管不十分精确，这种方法进行起来只有5％的错误率，这对绝大多数要求已经足够了。 3.2.8 通过作图标出DNA分子的限制性酶位点 在前述基础上，可以构建DNA分子的酶切图谱，以显示一定数量的不同内切酶的识别序列在DNA分子上的相对位置。 只有当一个限制性图谱(restriction map)获得的情况下，才能够正确选择用于特定酶切操作中的限制性内切酶。 构建限制性图谱，必须要进行一系列的 限制性消化。 首先，每个限制性内切酶消化所得到的片段的数量和大小必须要通过凝胶电泳，并对比标记物的大小确定出来。 这一信息必须随后被一系列双酶切加以补充，即DNA被两种限制性内切酶同时消化。 双酶切时，如果两种酶对pH和Mg2+浓度等有相似的要求，则双酶切可以同时进行。 如果要求不同，那么这两种酶切需要一个接一个地进行。在初次酶切后调整反应混合物，为第二种酶提供适宜的反应条件。 对比单酶切和双酶切的结果，能够使很多甚至全部的限制性位点作图标出。 模棱两可的地方通常可以通过部分酶切(partial digestion)来解决。即在某些条件下，DNA分子上只切开部分限制性位点。 部分酶切常通过