生物化学实验六酵母RNA的提取与含量测定山东大学实验报告.docVIP

实验六——酵母RNA的提取与含量测定 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-10 同组者：张奕 一、实验目的 1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用。 3.了解和掌握紫外吸收法测定RNA浓度的原理。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在260nm左右， 且一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比（浓度为5μg/ml—45μg/ml吸光度与浓度成正比），利用此性质，可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线(标准曲线的斜率为0.022-0.024左右)，测定样品RNA浓度。由于蛋白质在280nm的光吸收，对核酸测定有一定的干扰作用，最大吸收峰在280nm处，原因是蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白质的干扰必须得先测260nm处的吸光度，再测280nm处的吸光度，通过计算消除其对核酸的影响。 三、实验器材 干酵母粉 电子天平 量筒 容量瓶100ml 磁力搅拌器 试管 100℃水浴锅 pH试纸（pH1-14） 烧杯 离心机 722型分光光度计 锥形瓶 离心管 四、实验试剂 0.2%氢氧化钠溶液 95%乙醇 无水乙醚 酸性乙醇（5ml浓Hcl加入到500ml95%乙醇中混匀） RNA标准蛋白溶液（200μg/ml） 五、实验步骤 1.RNA的提取 （1）称取4g干酵母粉，放入200ml锥形瓶中，加入40ml0.2%的氢氧化钠 溶液混匀，在沸水浴中煮沸30min中并冷却； （2）冷却后，把液体倒入离心管中，在4000r/min的条件下离心15min； （3） 离心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml，边加边搅拌，静置5min左右，再4000r/min的条件下离心5min； （4）离心后保留沉淀，用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后在3000r/min的条件下离心5min； （5）离心后的沉淀再用无水乙醇10ml洗涤两次，每次用3000r/min离心5min； （6）离心结束后，收集沉淀与滤纸上，称重备用。 2.RNA样液的配制 （1）取粗RNA0.2-0.25g与烧杯中，加入5mlNaOH溶液，搅拌，溶解，调成糊状。 （2）再加入蒸馏水40ml，搅拌混匀，调PH至7.0后，放入100ml容量瓶中定容。 （3）再分3-4次分别取2ml定容后溶液于100ml容量瓶中继续定容待测,并且把容量瓶依次编号为A、B、C。 3.RNA标准曲线的绘制 （1）取洁净的试管，依次标号为1-10、A、B、C后，按照下表分别往各试管中加所需液体，并用磁力搅拌器混匀。 （2）混匀后以0号试管为参比液，在260nm下测各试管的吸光度A，并根据0-9试管的吸光值绘制出RNA标准曲线，并最终得出样品的浓度。 六、注意事项 1.离心机的使用，使用前一定要将两离心液（包括外壳）在天平上调平，对称放置在离心机上，防止力臂不对称而损坏离心机。 2.紫外分光光度计的使用，要先预热10分钟，往比色皿中到液体只需到三分之二即可，防止液体溢出腐蚀仪器，爱护仪器。 七、实验结果 1.RNA样液的配制 称取RNA样品的质量：0.200g 2.RNA标准曲线的绘制 表一 紫外光测RNA标准溶液配制表 编号 1 2 3(舍弃) 4 5(舍弃) 6(舍弃) 7 8 9 10 样品（ml） 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 水（ml） 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 总体积（ml） 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 浓度（μg/ml） 0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 A260nm 0 0.074 0.192 0.234 0.447 0.443 0.496 0.580 0.664 0.743 表二 紫外光测样品RNA浓度溶液配制表 编号 11 12 13 14 15(保留) 16 17(保留) 18 19 样品（ml） 2.5 1.0 0.5 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 水（ml） 2.5 4.0 4.5 9.8 9.8 9.8 9.8 9.8 9.8 总体积（ml） 5.0 5.0 5.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 总稀释倍数 200 500 1000 5000