下游技术概论2介绍.pptVIP

“三相纯化策略” 1) 富集(capture step) ：初步纯化，去除那些与目标蛋白质性质差异很大的物质及对目标蛋白质不稳定的物质如各种蛋白酶。离子交换、疏水作用、亲和层析，对层析介质的要求是流速快、载量大 2) 中间纯化(intermediate step)：去除那些在分子大小、理化性质与目标蛋白质类似的杂质，通常采用与富集时不同的层析技术，对分离介质的要求是选择性好(分辨率高) 、载量大,通常应用颗粒较小的介质 3）精制(polishing step)：最终去除那些痕量杂质,达到产品的纯度要求，凝胶过滤是这一步中经常使用的层析技术，对分离介质的要求选择性高 小 结 * Mini protein III （五）亲和层析 2 亲和层析方法 (1) 共价亲和层析 (2) 疏水层析 (3) 金属离子亲和层析 (4) 免疫亲和层析 (5) 染料亲和层析 （6）凝集素亲和层析 第四节酶的层析纯化 2 亲和层析方法 (1) 共价亲和层析 是生物大分子中的基团与层析剂上配基形成可逆性共价键的一种亲和层析方法。是根据巯基化合物与层析剂上二硫键的共价化学反应而设计的 第四节酶的层析纯化 2 亲和层析方法 (2)疏水层析 是酶蛋白中的疏水基团与亲和层析剂上的疏水基团进行可逆性结合反应的一种亲和层析方法 第四节酶的层析纯化 疏水层析介质制备过程示意图 2 亲和层析方法 (3)金属离子亲和层析 是酶蛋白分子中的一些氨基酸与层析剂上的金属离子进行可逆性螯和反应的一种亲和层析方法 第四节酶的层析纯化 应用：亚氨二醋酸盐与环氧活化的琼脂糖偶合,可以形成一种带有双羧甲基氨基琼脂糖,进而与过渡金属离子(Cu2+, Zn2+ Ni2+ ) 牢固螯合,形成稳定的吸附活性中心 吸附机理：金属螯合介质能与蛋白质中的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合 金属离子亲和层析 2 亲和层析方法 (4)免疫亲和层析：是利用抗原与抗体专一而可逆的反应进行的一种亲和层析方法 (5)染料亲和层析：是利用酶分子与一些染料上的基团进行可逆性亲和反应的一种亲和层析方法 （6）凝集素亲和层析：是利用酶蛋白与凝集素之间进行可逆性亲和反应的一种亲和层析方法 凝集素是一类能与糖的残基专一而又可逆结合的蛋白质。能与多糖、糖蛋白及红细胞和肿瘤细胞的凝集体等亲和层析。 第四节酶的层析纯化 （六）层析聚焦 原理: 在层析系统中，柱内装上多缓冲离子交换剂，当加入两性电解质载体的多缓冲溶液流过层析柱时，在层析柱内形成稳定的pH梯度。欲分离酶液中的各个组分在此系统中会移动到（聚焦于）与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的组分得以分离。 第四节酶的层析纯化 三 层析法特点与应用 （六）层析聚焦 层析聚焦系统的pH梯度，是利用多缓冲离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用自动形成的 用于色谱聚焦的含有两性电解质载体的多缓冲溶液已商品化 第四节酶的层析纯化 三 层析法特点与应用 第五节 酶的电泳分离 一、电泳 1 概念：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。 2 特点 快速、准确、重现性好 3 分类 支持体分：纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳及等电聚焦电泳等 下游技术概论 第五节 酶的电泳分离 一、电泳 4 原理：利用带电粒子在电场中泳动方向和速度不同而使组分分离的技术过程 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度 μ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt 影响μ的因素：1 颗粒本身所带电荷及大小、形状；2 外界因素包括电场强度、pH、离子强度、电渗、缓冲液粘度及温度等 在电场作用下，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。电泳中，由于与电泳支持物接触的液体因支持物的带电而感应产生相反的电荷，使液体分子移动。若电渗方向与电泳颗粒移动方向一致，则表观泳动速度大于本来的泳动速度；反之，则表观泳动速度小于本来的泳动速度 电渗（electroosmosis） 电渗示意图 第五节 酶的电泳分离 二、电泳方法 1 纸层电泳 2 薄层电泳 3 薄膜电泳 4 凝胶电泳 5 等电聚焦电泳 下游技术概论 4 凝胶电泳 是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。同时具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高，使分子大小不同的电解质得到分离。载体包括聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等 最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因：机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板