第七章植物原生质体培养及细胞融合讲述.ppt

原生质体培养意义 是植物细胞工程的核心技术。 1. 除去了细胞壁， 为植物细胞之间的融合扫平了障碍， 实现体细胞杂交，为制造新杂种开辟了道路。 (克服远缘杂交不亲和性) 2. 原生质体是各种遗传操作的理想受体， 从而可以进行品种的遗传改良。 可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒， 为高等植物的遗传饰变打下基础。 3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 材料预处理 意义 ▲提高原生质体的分裂频率； ▲逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。 方法 ◆暗处理 豌豆枝条取下后，分离原生质体前，先在黑暗中（一定湿度）放1-2d， 提高原生质体存活率高，并能继续分裂； ◆预培养 羽衣甘蓝先去叶下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，再去壁， 原生质体高度液泡化，叶绿体也解体； ◆低温处理 龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后，分离得到的原生质体才能分裂。 （在很多情况下材料不必经过专门的预处理） 细胞壁的组成 纤维素 半纤维素 果胶质 少量蛋白质 25-50％ 53％ 5％ 纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶 酶的种类及特点 ◆ 纤维素酶 主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等， 总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。 ◆ 半纤维素酶 降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。 ◆ 果胶酶 使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。 此外，还有蜗牛酶（主要用于花粉母细胞和四分体细胞）等。 如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。 ①糖溶液系统 包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂； ②盐溶液系统 包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。 　　 此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾， 提高原生质体的稳定性；使RNA酶不活化；并使离子稳定。 ◆pH 酶溶液的pH值 对原生质体的产量和生活力影响很大。 用菜豆叶片作培养材料时发现 原始pH值为5.0时，原生质体产生得很快， 但损坏较严重，并且培养后大量破裂。 当pH值提高到6.0时，最初原生质体却产生少， 但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。 原始pH值提高到7.0时， 生活的原生质体数量进一步增加， 损伤的原生质体也少得多。 分离叶肉原生质体的完整流程 2. 漂浮法 利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后 原生质体位于蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上， 残渣碎屑沉到管底。 先加蔗糖溶液（20%左右）， 酶处理混合液置于其上， 离心，150g，5min 用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤2-3次, 1-2ml液体培养基悬浮原生质体，备用。 优点：纯度高 缺点：收率低。 3. 界面法 采用2种或2种以上密度不同的溶液， 离心后使完整的原生质体处在两液相的界面。 最早Hughes(1978) 两液相 下层：450mM/L蔗糖 上层：450mM/L甘露醇 Piwowarczyk（1978）改进了上述方法 两液相 下层：培养基，含500mM/L蔗糖 中层：培养基，含140mM/L蔗糖，360mM/L山梨醇 上层：含原生质体酶液，含300mM/L山梨醇和100mM/LCaCl2 现在用不同连续梯度Ficoll（聚蔗糖）溶液， 上面为酶-原生质体混合液， 经离心（150g，5min）, 不同比重的原生质体漂浮在不同浓度梯度的界面上。 优点：收获的原生质体大小均匀一致。 缺点：收率低。 （二）原生质体活力的测定 1.以胞质环流作为进行活跃代谢的指标， 但对在细胞周围携有大量叶绿体的叶肉细胞原生质体来说， 这种方法的作用不大； 2.以氧的摄入量作指标， 摄入量可通过一个能指示呼吸代谢强度