chapter03克隆载体摘要.ppt

①由M13噬菌体的衍生而来，基因组8.7kb； ②结构组成：带有一个有来自p15A质粒的复制起点；带有一个有来自转座子Tn903的卡那霉素抗性基因（Kanr）；基因II有一个G-T突变。 ③M13K07进入细胞后复制成双链，表达产生子代单链噬菌体所必须的所有蛋白即包装蛋白。 1）辅助噬菌体M13K07 （4）pBluescript 噬菌粒载体（pBS） Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。 由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制起点和T3、T7噬菌体的启动子组成。 ② 特点 ① 组成 MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体RNA聚合酶，就可以定向体外转录。 1）定向体外转录 2）两种复制模式 既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。 3）选择方便 有Ampr和lacZ’，可以进行Amp抗性选择和X-gal-IPTG蓝白斑选择。 4）插入方便 18个单一酶切位点的MCS SK：表示lacZ’的转录方向是沿MCS上的 SacI ? KpnI +（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ’，能回收lacZ’的编码链（+） pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-） KS：反向（ KpnI ? SacI ，MCS相反） -（f1-）：能回收lacZ’的非编码链（-） 1）pBluescript SK/KS（+/-）区分： ③ 常用的 pBluescript 载体 pBS SK+ pBS KS- pCR系列载体 Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。 ① 结构 pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。 MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。 ② 特点 PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。 第五节 PCR产物克隆载体—T 载体 pCR2.1 pCR2.1的MCS 克隆的PCR产物能被两侧的EcoRI切下来回收。 Promega 公司的T载体系列 pGEM-T vector T vector的克隆过程——简便！ A A T T T vector PCR product T4 DNA ligase A A 7. 噬菌体展示载体（ Phage display vector） （1）噬菌体展示（Phage display） 将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。 G. P. Smith1985年发明。 丝状噬菌体（M13、f1等）外壳颗粒的一端，有3-5个基因Ⅲ编码的蛋白质（g3p），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。 M13 （2）噬菌体展示载体的构建 把外源DNA片段插入基因Ⅲ的序列前端，并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。 启动子 外源DNA M13基因Ⅲ ori M13 display vector 外源多肽 （3）利用亲和层析柱分离噬菌体 感染E.coli 分离质粒 亲和层析 小节 本章重点掌握内容： 质粒的概念、基本特征、 质粒载体的条件、组成及其主要功能、多克隆位点、标记基因及其作用原理；掌握α互补、插入失活；了解λ噬菌体的生物学特性；掌握λ噬菌体载体的类型和克隆基因的基本过程和主要应用；了解丝状噬菌体的生物学特性，生活周期；掌握丝状噬菌体的构建过程及其克隆基因的原理和用途。掌握噬菌粒载体的组成，特点；掌握T载体的组成特点及其主要应用。了解噬菌体展示系统的工作原理和应用。 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。 * 竞争 * 左侧区段：A-J，头尾部蛋白合成及装配 中间（非必要）区段：J-N 右侧区段：N-R噬菌斑形成，调控，复制（O,P）溶菌（S,R) * 75-105% * 噬菌体感染细菌形成的噬菌斑 第三节 单链噬菌体载体 M13、f1、fd 噬菌体 单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13 噬菌体 （2）复制型（RF）是双链环状DNA。 1. 单链DNA噬菌体的特点 （3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。 （5）可产生大量的含有外源DNA插入片 断的单链分子，便于作探针或测序。 （1）+DNA。（ssDNA） （4）不存在包装限制。 一、 M13 噬菌体 1复制蛋白（基因II, V, X） 2形态发生蛋白（基因I, IV, XI） 3结构蛋白（基因III,VI,VII,VIII,IX） 基因组DNA+链 M13噬菌体是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。 但M13 D