分子生物学之DNA复制预案.ppt

One strand replicated as continuous segment E. coli DNA pol I (polA) 1. easily cleaved into two fragments by proteinase: a. large fragment (Klenow fragment) contains polymerase and 3’-5’ exonuclease (proofreading domain). Used in vitro for synthesis reactions (DNA sequencing). Proofreading by DNA polymerase 接着单链结合蛋白（single-stranded binding protein, SSB）与解旋酶解开的单链结合，其作用是防止单链降解，阻止单链退火。SSB蛋白与单链DNA的结合有协同效应(cooperative)，即一个SSB的结合会促进另一个SSB与单链DNA的结合。这种协同结合使单链DNA被解旋酶释放出后，很快被SSB所覆盖。一旦被SSB覆盖，单链DNA即处于伸直状态，有利于其作为模板进行DNA合成或RNA引物的合成。 在大肠杆菌细胞中，DNA解旋酶募集一个引物酶。引物酶负责合成一段短的RNA引物。 二、 Elongation 一旦复制起始，复制叉就沿着DNA分子前进，合成与亲本链互补的两条新DNA链。新生链的合成由DNA聚合酶催化完成。从大肠杆菌细胞中分离出了5种DNA聚合酶。DNA聚合酶III是大肠杆菌DNA复制中链延伸反应的主要聚合酶。DNA聚合酶I专门用于RNA引物的去处。另外3种DNA聚合酶主要参与DNA修复和跨损伤合成。 1．DNA聚合酶I DNA pol I由一条多肽链组成，分子量为109 KD。酶分子中含有一个Zn2＋，是聚合酶活性必需的。用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个片段，大片段的分子量为76 KD，通常称为klenow片段，小片段为34KD。大小片段具有不同的酶活性。 N C Klenow fragment (68 kD) exonuclease 3’-5’ polymerase site small fragment (35 kD) C 5’-3’ activity proofreading exonuclease catalytic （1）DNA聚合酶的5→3聚合活性 这是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸顺序，将互补的dNTP逐个加到引物RNA3’-OH末端，即促进3-OH与dNTP的5-PO4形成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用，5→3聚合活性存在于klenow片段上。 DNA聚合酶I的延伸能力不强，每次与模板－引物结合仅能添加20～100个核苷酸。 （2）DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶 （exonuclease)活性 这种酶活性的主要功能是从3’ →5’方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对的核苷酸，这种功能称为校对功能（proofreading），这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于维持DNA复制的真实性（replicational fidelity）至关重要。 (3)DNA聚合酶的5→3外切核酸酶活性 这种酶活性是从DNA链的5’端向3’末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除10个核苷酸。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用，对完成的DNA片段去除5’端的RNA引物也是必须的。 DNA polⅠ的5→3聚合活性和5→3外切酶活性协同作用，可以使DNA一条链上的切口从5→3方向移动，这种反应叫做缺刻平移(nick translation) 2. DNA Polymerase III (DNA聚合酶 III） DNA聚合酶III由10个不同的亚基构成。其中α、ε和θ亚基构成核心酶。α亚基具有5→3 聚合酶活性，ε亚基具有3→5外切活性，θ亚基功能尚不清楚，可能仅仅起结构上的作用，使两个核心亚基以及其他各辅助亚基装备在一起。DNA聚合酶III具有两个拷贝的核心酶。 (Note: no beta subunits are shown; without beta, this form of the complex is called DNA pol III*) 两个拷贝的β亚基围绕DNA双螺旋形成一个环状的二聚体。一旦β亚基二聚体与DNA紧密结合，它的作用就像一个“滑动夹子”(sliding clamp)携带着核心聚合酶沿着DNA链自由滑动。这样，聚合酶的活性位点就可以一直定位在生长中的复制叉附近。另一方面，核