第六章分子生物学研究方法——基因功能研究技术说课.pptVIP

* 生科院 * 用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验 * 生科院 * 正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞 2. 高等动物基因敲除技术 技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法 把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发 生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。 显微注射命中率较高，技术难度相对大些。 电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。 * 生科院 * * * 生科院 第二节 基因敲除技术 * 生科院 * 模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用 3. 植物基因敲除技术 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失 活”。 * 生科院 * * * 生科院 第二节 基因敲除技术 * 生科院 * 植物基因敲除及突变体筛选 a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段 引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。 b. PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。 水稻T-DNA插入的突变体库 水稻T-DNA插入的突变体库 矮秆突变体 雄性不育突变体 叶色突变体 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 1. 酵母单杂交系统 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。 * 生科院 * * * 生科院 * 生科院 * 从拟南芥cDNA文库中 筛选与顺式元 件DRE结合的 转录因子示意图。 酵母单杂交的基本原理示意图 2. 酵母双杂交系统 真核生物转录调控因子具有组件式结构 （modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以 上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域 （binding domain，BD）和转录激活结构域 （activation domain，AD）是转录激活因子发挥 功能所必须的。 BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转 录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合 蛋白却能行使激活转录的功能。 * 生科院 * * * 生科院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 * 生科院 * 酵母双杂交的基本原理示意图 3. 体外蛋白质相互作用技术 Far Western印迹技术 用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测 与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白 的cDNA。 * 生科院 * * * 生科院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 3. 体外蛋白质相互作用技术 GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲 和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作 用蛋白。 * 生科院 * * * 生科院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 3. 体外蛋白质相互作用技术 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的 相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质 芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可 以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相 互作用蛋白点。 * 生科院 * * * 生科院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 3. 体外蛋白质相互作用技术 等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米 级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过 时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折 射率上升，导致共振角度的改变。 * 生科院 * * * 生科院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 3. 体外蛋白质相互作用技术 免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可 能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入 反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法 在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合 物沉淀到试管的底部或微膜上。 * 生科院 * * * 生科院 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 4. 细胞内蛋白质相互作用研究