第三章蛋白质样品的全息制备说课.ppt

一、亚细胞蛋白质组学的概念 亚细胞蛋白质组学是针对细胞内不同区域结构功能单位的蛋白质组学进行研究。 细胞内可分成不同细胞器或细胞区域,如细胞膜、线粒体等。 另外,细胞内一些功能单位多是分子结构体或多蛋白复合体,如核基质、剪接体、纺锤体、核孔结构及核糖体等。 这些细胞器、多蛋白组成的功能单位的区域化分布和聚集方式决定该细胞的功能是亚细胞蛋白质组学研究的主要对象。 研究亚细胞蛋白质组学的意义在于: ①可以富集低丰度的蛋白质,完善全细胞蛋白 质组; ②提供蛋白质的亚细胞定位信息; ③加深对亚细胞组分的结构功能理解; ④加深对细胞生理分子机制的理解; ⑤研究亚细胞蛋白质组的差异表达谱。 亚细胞分离过程概括起来有两个主要步骤: 1.组织匀浆，在适当条件下破碎细胞 2.细胞器分离，以不同方法将不同细胞器进行分级分离。 二、亚细胞器分离的技术基础 匀浆的目标是: ①用可重复的方法获得最大限度的细胞裂解; ②所使用的破坏力对目标细胞器伤害最小; ③保留目标细胞器的结构和功能的完整性 超速离心法是分离和提取生物大分子及亚细胞单位结构的重要手段之一,这主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度不同,在不同离心力场下进行差速离心或不同密度梯度离心,从而获得不同亚细胞组分。 尽管分离亚细胞组分的目标应是最大限度地减少对所分离细胞组分的破坏,然而实际上目前的分离技术根本无法达到即在自然状态下分离,同时又不破坏细胞器的要求。目前也没有任何一种分离组织的方法可以适用于所有的组织,适用于某一组织的亚细胞的分离方法并不一定就适合于分离另一组织的细胞器。 (一)亚细胞器及其蛋白质分离常用技术 1.细胞的破碎方法 破碎培养细胞或者破碎组织细胞可以采用渗透压冲击、超声波震荡、机械研磨等各种方法。整个过程可以通过显微镜实现监控以确保细胞器结构上的完整。 2.差速离心与密度梯度离心法 匀浆产生的细胞裂解物通常通过一系列差速离心步骤和一个密度梯度来分离细胞器和粒子。 一般来说,先进行差速离心得到沉淀,然后再在密度梯度中进行超速离心,这种逐渐加大离心力的顺序离心及密度梯度离心的选择将分别根据细胞成分的大小和密度 来分离。 3.免疫共沉淀法 信号复合体一般不能通过密度梯度离心纯化,而免疫共沉淀是一个比较理想的方法,将目标信号分子蛋白从细胞或亚细胞组分中沉淀后,供质谱技术鉴定和基因功能分析。 4.亲和层析法 选择一定的配体或配基,可将细胞或亚细胞内不同亲和特异性的蛋白质组分逐一分离出来并继以蛋白质组学研究。 (二)亚细胞器的分离及蛋白质提取 1.线粒体 线粒体在亚细胞蛋白质组学研究中占有重要的地位,它是细胞内含量最丰富的细胞 器,由一个双层膜系统组成,外膜与内膜隔开并包围着内膜,在内膜的内侧为基质。线 粒体具有能量转换、物质运输、调节离子平衡、信息传递和合成腺昔三磷酸等功能。在 动物发生疾病或植物发生病害后,线粒体的呼吸相关酶系均要发生变化,而且线粒体已 发现是某些植物病原菌毒素的作用位点。因此,分离线粒体蛋白对于动植物致病和抗病 机理的研究具有重要意义。 线粒体分离的基本步骤 是切取组织、细胞匀浆,然后通过差速离心或密度梯度离心 获得。 线粒体提取液为预冷的MB缓冲液,一般要在4°C下10 000 g 左右反复离心。通过非连续Nycodenz密度梯度法进一步将线粒体纯化。线粒体一般在 33% Nycodenz溶液和36%的Nycodenz界面处形成一个薄层,收集该层后用3倍MB 缓冲液稀释, 11 700 g离心10 min,留沉淀,重悬于MB缓冲液中。 MB缓冲液(甘露醇210 mmol/L,庶糖70 mmol/L,起 乙基月!反嗦乙硫磺酸10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, pH7. 5), 所得到的线粒体用 常规细胞裂解液(8 mol/L服, 4 % CHAPS, 65 mmol/L DTT, 40 mmol/L Tris)抽提 蛋白质,用蛋白质浓度检测试剂盒测所得蛋白质的浓度。 线粒体相对纯度可以通过检测线粒体和其他可能存在的细胞器的标志酶来确定,包 括单胺氧化酶、腺苷酸激酶、细胞色素氧化酶C等。 2.高尔基体 高尔基体是细胞内大分子加工和运输的一个主要的交通枢纽。 研究植物高尔基体蛋白质组学,可使人们认识植物细胞壁多糖合成与转运机理,以及植物生长环 境变化对这些过程的影响。 (三)蛋白质亚细胞定位的验证技术 由于获得完全纯化的亚细胞组分很难,因此为了验证亚细胞蛋白质组的研