第四章工具酶及应用研讨.pptVIP

* 4.TaqDNA聚合酶 耐热的 DNA聚合酶。最适反应温度75 ～80oC，主要用于聚合酶链反应。 * 5.逆转录酶（reverse transcriptase ） 作用：以RNA为模版，合成 cDNA (Complementary DNA) 该类酶有三种活性 ① RNA依赖的DNA聚合酶活性 ② DNA依赖的DNA聚合酶活性 ③ 外切RNA的活性 * 常用的逆转录酶有两种： AMV－来自于鸟类骨髓母细胞瘤病毒 M-MLV－来自于莫络尼鼠的白血病病毒 * 二 . T4DNA连接酶 催化两个DNA片段的3’-OH和5’-P末端 形成磷酸二酯键 该酶是大肠杆菌T4噬菌体的DNA30编码的产物，分子量68kd。现已由基因工程菌表达。 * DNA 连接酶 “分子针线” * DNA连接酶 连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。 * 主要功能　降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA的实验中谨防RNA酶污染。 三.RNA酶 * 四.核酸酶SI 降解单链 DNA 或 RNA，形成5’-P的单核苷酸或寡核苷酸片段 对DNA的活性比对RNA的强 产生平末端 * 五 .碱性磷酸酶 切除DNA或RNA的5‘-P 防止DNA自身环化 5’ p－ TTAGCTAGGCCC … TCAATCGGTACG －OH 3’ 3’ HO-AATCGATCCGGG … AGTTAGCCATGC－p 5’ * * 第四章 基因工程的工具酶 及其应用 * TOOLS FOR GENE CLONING SCISSORS: RESTRICTION ENZYMES GLUE: DNA LIGASE VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS * 　基因工程的工具酶 定义 用于DNA或RNA切割和连 接的各种酶叫做工具酶。 * “分子剪刀”的发现者 * 第一节　 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) 是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。 * 在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。这种细菌内部的限制与修饰作用分别由核酸内切酶和甲基化酶完成，构成了类似免疫的防御系统。 * 解释 何谓内切酶 -o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o- 红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点 * 限制性核酸内切酶的分类 目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程； 特点：识别切割位点比较专一，只有切割作用。无甲基化修饰作用。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性核酸内切酶同时具有内切活性和甲基化修饰活性，且识别位点复杂，特异性差，不适用于基因工程。 * 一.限制性内切酶的命名 Hind Ⅲ H in d Ⅲ 细菌属名的第一个字母 细菌种名的前两个字母 细菌菌株的第一个字母 同一菌株中发 现的第三种酶 * EcoRI E co R I 细菌属名的第一个字母 细菌种名的前两个字母 该酶的基因位于R质粒上 该菌株发现的 第一种内切酶 * * 二. II型限制酶的识别特点 识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序的固定位置切割，识别顺序为回文结构。（Palindrome） 客上天然居 居然天上客 * * EcoRI PstI HpaI 5 3 3 -G ACGTC- -CTGCA G- 5 5 3 -G AATTC- 5 3 -CTTAA G- 5 5 3 3 -GTT AAC- -CAA TTG- 5 sticky end 5粘末端 3 sticky end 3粘末端 blunt end 平末端 三. 限制性内切酶的切割方式 * 四.识别位点与切割方式 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5