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细菌内毒素理论 袁世杰 细菌内毒素检查基础理论 在药品生产质控上的应用 内 毒 素 细菌内毒素检测技术的应用与进展 细菌内毒素检测技术的应用与进展 1、热原 2、历史回顾---鲎试剂与细菌内毒素检查 3、BET的发展趋势与特点 1、热原 热原是指临床上能引起哺乳动物发热反应的物质 Webster最先把热原定义为“致热剂” 早期的热原研究 静脉疗法的研究与热原的研究密切相关 在18、19世纪有很多关于静脉疗法的报道，所有病人在注射后都伴随有发热反应，当时的医生都深信发热对人体有益 1912年，Hort和Penfold阐明注射发热的真正本质，将细菌分为热原和非热原两种： 革兰氏阴性细菌为热原细菌 革兰氏阳性细菌为非热原细菌 他们推断所有的注射发热都是由革兰氏阴性细菌产生一种可滤过的、热稳定的物质导致的 细菌内毒素检测技术的应用与进展 热原的检测 1941年，美国USP、FDA和NIH（美国国家卫生研究所）邀请了14个制药厂商参与第一次的热原协作研究 1942年，美国药典第一次收载热原检查法 该方法是将一定量的供试品通过静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况来判定供试品中热原含量是否符合规定 细菌内毒素检查(BET) 通常称使用鲎试剂来检测细菌内毒素的方法为细菌内毒素检查法。 细菌内毒素检测技术的应用与进展 2、历史回顾---鲎试剂与细菌内毒素检查 细菌内毒素检测技术的应用与进展 国际 1956年，美国科学家Frederic Bang发表论文《鲎的一种细菌性疾病》，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象.随后，Bang和Levin发明了鲎试剂。 1980年，FDA发表使用鲎试剂检查人用和兽用注射药终成品内毒素的指引；美国药典20版（USPXX）第一次收载BET法 1989年英国药典收载BET法 1991年日本药局方收载BET法 1999年，USPXXIV版规定670种药品用BET法检查，保留热原检查的药品约20种 2000年，国际协调委员会使USP、EP和JP达成《BET的国际协调方案》，统一的BET法收载于USPXXIV版NF19的第二增补本中，并于2001年1月1日生效 国内 1983年，由11个单位参加的卫生部鲎试剂研究协作组的成立 1988年，卫生部颁布《细菌内毒素检查法》和鲎试剂标准 细菌内毒素检测技术的应用与进展 1991年，卫生部部颁标准规定4种药品可使用细菌内毒素检查法 1993年，中国药典（CP）九零版第二增补本收载BET法 1995年版CP规定13个品种使用BET法 2000年，CP2000版细菌内毒素检查品种增至69种；附录《细菌内毒素检查法应用指导原则》中收录了BET定量法 2005年，CP2005版细菌内毒素检查品种增至168种；BET法正式收载光度测定法。 2010年，CP2010版细菌内毒素检查品种增至450多种。 细菌内毒素检测技术的应用与进展 3、BET发展趋势与特点 BET技术的发展趋势 细菌内毒素检查取代热原检查 自19世纪80年代FDA批准鲎试验的应用以来，BET法所具有的优点：快速、灵敏、可标准化等，表明它比热原检查法更适应现代制药工业的发展 各国药典规定的BET检查品种都经历了从无到有，从少到多的过程 BET取代热原检查已成为趋势 细菌内毒素检测技术的应用与进展 走向统一的BET法 在初期各国颁布的BET法不尽相同，不利于药品的全球流通 WHO实现了内毒素的国际标准品（IS）的效价（IU）与各国内毒素标准品的效价（EU）的统一，即1IU=1EU 国际协调委员会综合USP、EP、JP的BET法，达成一个国际协调案——统一的BET法，于2001年实施 中国药典2010年版的BET法基本参照国际统一的BET法 细菌内毒素检测技术的应用与进展 BET技术的应用及发展的特点 BET方法呈多样化 凝胶法 比浊法 动态比浊法 终点比浊法 比色法 动态比色法 终点比色法 细菌内毒素检测技术的应用与进展 细菌内毒素 化学成分及特性 是革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 是高分子量脂多糖（LPS）的复合物 单体分子量介于10，000至20，000道尔顿 典型地以100，000至500，000道尔顿的聚合体形式存在 细菌内毒素检查基础理论 特性 致热性 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原刺激下丘脑体调节中枢，使人体发热升温 耐热性 需要在250摄氏度干热30分钟才能彻底灭活 分子极性 多糖链端有亲水性，脂肪链端具有疏水性，在水中呈不均匀分布 酸碱性 与强酸强碱水解反应，可灭活内毒素 鲎反应性 能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶 除上述性质外，LPS还有许多其它的生物活性 细菌内毒素检查基础理论 化学结构 含有3个截然不同的区域 O-特异