免疫学技术20141016(盐析)讲述.pptVIP

凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶 葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。 市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex G–l0～15通常用于分离肽及“脱盐”。Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。 凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。 为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。 装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。 加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。 洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。 洗脱液的收集与检测 凝胶柱的重复使用与保存 保存方法有三种： 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。 注意事项 刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。 在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。 平衡装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱，以压实凝胶，称为平衡。 上样时，应该注意上样量的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说“脱盐”层析时，上样体积可为柱体积的10%～25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的1%～5%。样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要达到0.08，以免产生特异性吸附。 凝胶过滤的各种条件：根据具体的实验要求来选择 凝胶类型 层析柱大小 洗脱液 上样量 洗脱速度… 例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶过滤要有较高的分辨率 提高分辨率的选择应主要包括： 选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶 选择颗粒小的凝胶 选择分辨率高的凝胶类型 选择较长、直径较大的层析柱 减少加样量 降低洗脱速度 （三）根据蛋白质带电性质进行分离 离子交换层析法 电泳法 离子交换层析法 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。  （三）根据蛋白质带电性质进行分离 离子交换层析法 电泳法 电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得