第二节石蜡切片制作解说.ppt

石蜡切片的制作 简介： 石蜡切片是教学与研究工作中广泛运用的一种实验技术，特别对于细胞学、组织学、胚胎学、病理学，更是一种必备的研究方法。对于不同的显微镜具体的制作切片的技术也是不同的！ 现在以苏木精、伊红染色的常规制片为例作具体讲解！ 整个石蜡切片的完成过程 各种药品的配制及器材准备 染色液的配制 固定液的配制 梯度酒精的配制 采样器材的准备 染色液的配制 Ehrlich氏苏木精 苏木精：2g; 无水乙醇：100ml； 冰醋酸：10ml； 铝化钾或硫酸铝钾：10g； 蒸馏水：100ml； 甘油：100ml。 配制方法： 1.将铝化钾或硫酸铝钾溶于蒸馏水中（加热至40~45℃）； 2.将苏木精溶于无水乙醇中，再加入冰乙酸、温热的铝化钾或硫酸铝钾溶液，最后加入甘油； 3.配置完成后，置于温热和阳光充足处，成熟3个月，即可使用。 伊红溶液的配制 1.伊红酒精溶液的配制： 伊红Y（0.5-1.0g）+95%无水乙醇（100ml），过滤。混合即可使用。 2.伊红水溶液的配制： 伊红Y（0.5-1.0g）+100ml蒸馏水，溶解至溶液中无伊红沉淀，过滤即可使用。 0.5%~1%盐酸酒精溶液的配制 浓盐酸（0.5~1ml）+70%~90%酒精溶液100ml，混合均匀即可。 注意事项：因为浓盐酸对皮肤具有强烈的腐蚀作用及对呼吸道具有刺激作用，因此在配置的过程中一定要注意自身的安全。 固定液的配置 10%福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛溶液+900ml蒸馏水。 10%缓冲中性福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛溶液+900ml蒸馏水+4g磷酸二氢钠+6.5g磷酸氢二钠。 10%中性福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛+900ml水+碳酸钙加至饱和充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。 4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液：4g多聚甲醛+100ml磷酸盐缓冲液（适用于免疫组化学技术）。 不同浓度梯度酒精配制 梯度酒精的作用： 将组织中的水分经过梯度酒精的作用，置换出来，以达到组织脱水的目的。 配制：例如70%的酒精配制，70ml（100%纯酒精）+30ml蒸馏水混匀即可。 石蜡切片所需的实验器材 仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片、镊子、手术刀。 材料：小鼠的组织（小鼠肝脏）。 试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、中性树胶。 第一步：取材 一般根据观察目的选取动物或人体组织，取材要迅速，组织块不宜太大，一般为组织学观察，取黄豆大小为宜。取材要用锋利的刀剪，不可用钝刀，更不可用力压、揉、挤等，以免损坏组织。 第二步：固定 无论何种器官、组织，要制成切片，首先需要固定。目的在于保存组织原有的形态，同时使之易于染色。固定要求： 1：能迅速使蛋白质变性，使细胞维持原来的形态，既不收缩又不变形。 2：固定剂必须也是保存剂，使组织在其中不易腐烂。 3：固定剂应有较强的通透能力，以保证组织块的内部也能被及时的固定。 4：固定后的组织应软硬适宜，便于切片。 5:固定后的组织应容易被染料着色。 ！注意:不同固定剂固定时间不一样。具体问题具体分析。 第三步：冲洗、脱水、透明。 冲洗的目的在于弃去组织中过剩的固定剂，以免固定剂沉淀于组织之中影响切片的质量。 脱水的过程就是用梯度酒精逐步取代水的过程，组织脱水一般由70%——80%——90%——95%——100%梯度酒精完成。在95%的时间可以稍长（注意：70%以上的酒精要回收利用）。 脱水之后，将组织块放入100%的酒精+二甲苯溶液（1：1）再放入二甲苯溶液直到组织块透明为止，透明需要半小时到一小时左右。 第四步：浸蜡包埋 由二甲苯透明的组织块经过二甲苯+石蜡后，即可进入纯蜡中，一般浸蜡在温箱中进行，温度稍高于石蜡的温度，蜡质由于冬夏的温度不同而进行选择。 注意：熔蜡及浸蜡温度保持在65℃左右。 经过浸蜡之后的组织，必须包埋好才能切片。 第六步：切片 切片之前必须修整好蜡块，并且固定在木块之上，再将四周多余的残蜡用刀片削去，否则不易于切片和展片。 切片使用旋转切片机时，应固定好木块；调整好切片刀与蜡块的距离与角度，一般刀的倾斜度为4-6度；根据切片的厚度不同调节厚度标志器，在操作的过程中还应注意自身的安全。 石蜡块的固着与整修 在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。 固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm