细胞基因组DNA的备及其浓度、多聚酶链反应.docxVIP

PAGE5 / NUMPAGES5 医学分子生物学实验技术 实验报告 实验名称：细胞基因组DNA的制备及其浓度、多聚酶链反应 一、实验目的 1．掌握基因组DNA提取的基本方法。 2．利用紫外分光光度计，测定DNA的浓度和纯度 3．学习并掌握PCR的基本原理与实验技术。 二、实验原理 1.基因组DNA提取 基因组DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在。结合力：氢键，离子键…… 破坏结合力：可以使两者分开。一般采用去污剂、蛋白质变性剂、蛋白酶等裂解细胞并使核酸与蛋白分开，去除蛋白质通常采用有机溶剂酚和氯仿，最后用乙醇、异丙醇、等有机溶剂对水相中的核酸进行沉淀，最后用70%的乙醇进行洗涤、干燥、溶解即可得到基因组DNA. 2. 测定DNA的浓度和纯度 DNA, RNA中嘌呤环和嘧啶环的共轭双键有紫外吸收特性，吸收峰在260nm，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。DNA浓度＝A260/(0.02×D)×稀释倍数，0.02：每毫升溶液含有1ug DNA 钠盐时的光密度为0.02；D：比色杯光径（cm）, 本实验值=1 cm DNA纯度判定： 蛋白质中酪氨酸和色安酸的苯环共轭双键有紫外吸收特性，吸收峰在280nm，干扰核酸的测定。A260/A280： DNA～1.8； RNA～2.0；﹤1.75，蛋白质含量高。 3. PCR的基本原理 该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。 PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 4 三、实验步骤 1基因组DNA提取 1.1收集细胞 1.1.1取1瓶HL60细胞，用滴管吹打使细胞散开成单细胞， 1.1.2转入15 ml离心管，4℃，3,000 rpm离心5 min，弃尽上清。 1.1.3加入10 ml TBS重悬细胞，4℃，3,000 rpm离心5 min，弃尽上清， 1.1.4将离心管倒置于纸巾上1分钟。 1.2裂解细胞： 1.2.1向细胞沉淀中加入0.2 ml TE（pH8.0），吹打使细胞悬浮 1.2.2加入2 ml 抽提缓冲液和4.4 μl 10 mg/ml的RNase ，颠倒离心管数次以混匀,37℃温育1小时。 1.2.3加入11μl 20 mg/ml的蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，颠倒离心管数次以混匀 将裂解细胞的悬液置于50℃水浴中3小时，不时旋动。 1.3纯化DNA： 1.3.1溶液冷却至室温，加等体积的平衡酚缓慢地来回颠倒离心管10分钟， 1.3.2室温4800 rpm离心10分钟，使两相分开。 1.3.3用大口径滴管（出口直径0.3cm）将粘稠的水相移至另一15ml离心管中，加入等体积的酚:氯仿重复抽提至两相界面无白色物质存在（一般重复两次）。 1.4沉淀并溶解DNA： 1.4.1在水相中加入2倍体积的无水乙醇，颠倒离心管数次以充分混合室温4800 rpm 离心5分钟。 1．4.2弃上清，DNA沉淀用0.5ml70％乙醇悬浮，转入1.5ml离心管，10000 rpm离心5分钟。 1.4.3弃上清.尽可能彻底除去70％乙醇，室温下将离心管盖敞开，于空气中自然干燥直至痕量乙醇挥发殆尽。 1.4.4加50μlddH2O，放入4℃冰箱任其慢慢溶解。隔日测定DNA浓度。 2. 测定DNA的浓度和纯度 2.1以ddH2O作参照，取4微升DNA溶液点样于BioTek 微孔板里，标记好。