功能基因组-荧光实时定量PCR原理及应用分析.pptVIP

荧光实时定量PCR原理及应用 l 实时荧光定量PCR检测技术的原理 RQ—PCR技术是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。Ct值(cycle threshold，Ct)，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 2 实时荧光定量PCR检测技术的分类 根据所使用的荧光化学物质的不同，实时荧光定量PCR主要分为2类，分别是荧光探针和荧光染料。荧光探针又可分为水解探针、双杂交探针、分子信标和复合探针。荧光染料目前主要是以SYBR Green I为主的一种扩增序列非特异性的检测方法。 2.1水解探针 以TaqMan探针为代表的水解探针，又叫外切核酸酶探针。其原理是应用Taq酶天然的5-3’核酸外切酶的活性。如图所示。能够使双链DNA的5’核苷酸裂解单核苷酸释放。根据Taq酶这一特性，依照目的基