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第四章 DNA重组和基因转移 第一节 目的基因与载体的连接 一 粘末端DNA片段的连接 （一）具有相同粘末端的DNA分子 之间的连接 使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。 （二）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。 HindIII EcoRI HindIII EcoRI 对载体酶切 HindIII EcoRI 对基因酶切 质粒载体的定向重组 二 平末端DNA片段的连接 1 直接用T4连接酶连接 2 同聚物加尾法 3 衔接物连接法 衔接物是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。 所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的DNA片段上的酶切位点不相同，因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端。 1 按照平末端连接方法加上接头 2 将凹端变为平端 （1）使用Klenow酶在4种dNTP存在下，将3′凹端完全补平。 （2）用S1核酸酶去除3′突出末端产生平端DNA分子 三 载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接 3 使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平3′凹端转 变成粘端。 载体经